PCR断片のベクター挿入

質問

制限酵素によるマッピングを行い、目的のがPCR断片が挿入されているか、ベクターにどのような向きに挿入されているかの確認がよくわかりません。そもそもマッピングがよく理解できていません。どなたかわかり易く説明してくださったら助かります。

回答No.3

MIYD · ベストアンサー

コロニーPCRが(予算的に？)出来るのでしたら、

当たり
　　→　　　　　　　　　　←　　　　　　　　　　　　　←
---(1)-------□□(3)□(→)□□□□---(2)-----
逆向き
　　　→　　　　　　　　　　　　　　　→　　　　　　　←
---(1)-------□□□□(←)□(3)□□---(2)-------
空
　　　→ 　　　　　　　　←
---(1)------- ---(2)---------

(1)(2)(3)はプライマーが結合する配列(向きは上の矢印の向き)
で、

(1)(2)のプライマーの組み合わせでPCRすると、出来るPCR産物の長さは
(1)-------□□(3)□(→)□□□□---(2)
(1)-------□□□□(←)□(3)□□---(2)
(1)------- ---(2)
となってはずれのクローンがわかって、

(1)(3)でPCRすると
当たり
(1)-------□□(3)
逆、空
増えない
となりますのであたりのクローンがわかります。

ただ、増えない時は当たりのクローンでないのか、それともコロニーPCRでプレートの寒天をPCRチューブに持ち込んだためにPCR反応が阻害されてしまったのかわからないので、
当たりのものが増える条件（この場合は(1)(3)の組み合わせ）で増やす必要があります。

お礼

回答ありがとうございました。

回答No.2

noname#129052

PCR断片が挿入されているかどうかを確認する場合、プラスミドを抽出し、制限酵素処理をするのが普通ですが、最も手っ取り早いのがコロニーPCRです。コロニーを爪楊枝等でつつき、それをPCRチューブの底にこすり付けます。そして、20μlぐらいの計でPCRします。PCR断片が増幅された菌が当たりです。また、断片の向きはベクターにある他のユニークサイトで処理し電気泳動のパターンから分かります。

お礼

回答ありがとうございます。

回答No.1

MIYD

たとえば当たり、逆向き、空のベクターを

当たり
---●-------□●□□(→)□□□□--------
逆向き
---●-------□□□□(←)□□●□----------
空
---●------- ------------

●制限酵素サイト
□ＰＣＲ断片
---ベクターＤＮＡ
→インサートの向き

とすると
●で切れる制限酵素でこのＤＮＡを切断すると、

当たり
●-------□●＋残り
逆向き
●-------□□□□(←)□□●＋残り
空
1cutのベクターの長さのDNAだけ

の長さのDNA断片が得られます。
このDNAの長さを電気泳動して調べることにより、
PCR断片の向きがわかります。

お礼

非常にわかり易い説明ありがとうございます。