ＤＮＡ断片のクローニング実験について

質問

初めまして。実験レポートの課題で苦しんでいます。どなたかアドバイスをお願いいたします。

　実験は、（１）組換えプラスミド（ｐＵＣ１１９＋挿入ＤＮＡ断片）を宿主大腸菌ＤＨ５αＭＣＲに導入し、抗生物質とＸ－Ｇａｌの入ったＬＢ寒天培地上でカラー選択する。（２）形質転換体と思われるアンピシリン耐性株からプラスミドＤＮＡを回収し、どれくらいのサイズのＤＮＡ断片がベクターに挿入されているか制限酵素による切断とゲル電気泳動により確認するというものです。

　課題ですが、「今回の実験で白色コロニーからプラスミドＤＮＡを回収したが、ベクターに挿入ＤＮＡ断片が入っていなかった。また、薄青色コロニーからプラスミドを回収したところ、ＤＮＡ断片が挿入されていた。この理由をベクターのクローニング部位の切断面、lacZ遺伝子と挿入ＤＮＡ断片との連結状態に注目して説明せよ。」というものです。

　正直、生物の実験は初めてで良く分かっていないところも多く、難しいです。アドバイス、ヒント等よろしくお願いいたします。

回答No.2

yakyutuku

DNAは３っつづつコドンが組まれるため、挿入断片が３の倍数のとき、挿入されたDNA断片に対応するアミノ酸配列が入るものの、前半と後半はもとのままのため、酵素としては機能を失っていないとそうなります。

お礼

ありがとうございました。参考にさせて頂きます。本当に助かりました。

回答No.1

bzxjpjp

lacZ遺伝子はベータガラクトシデースというタンパク質をコードしています。（実際にプラスミドにコードされているのは遺伝子の一部です。）

そこに、DNA断片を制限酵素を用いて組み込むと、ベータガラクトシデースの酵素活性がなくなるのでホワイトコロニーになるわけですが、
DNA断片がlacZの読み枠と一致すると酵素活性が完全に失われないことがあります。

お礼

ありがとうございます。なんとなくですが分かりました。丁寧な説明で助かりました。