制限酵素処理で目的のインサート以外も切れました。

質問

スリーピースライゲーションを行い制限酵素処理（Nde I/BamH I)で確認したところ、目的の断片以外にもうひとつ断片がでました。この制限酵素でベクター、インサートと共に切れる場所はないので、困っています。原因はなんでしょうか。

回答No.1

geneticist12 · ベストアンサー

一番ありそうなのは、もう１ピース紛れ込んでいるという可能性ですが、それだけの情報では何が起こっているか断定することはできません。

せめて、どういう末端のどれくらいの大きさの断片をどういうベクターに入れようとしたかという情報がほしいです。

泳動して確認したベクターのサイズは合っているのですよね。ならば、ベクターが切れたためというのは、はなから問題外です。

とにかく、それぞれの酵素でsingle digestして泳動してみましょう（人に尋ねる前にそれくらいはやりましょうや）。バンドパターンが予想とどう違いますか？

回答No.5

joyjoyjo

泳動パターンの情報はほしいところですねw。

目的外の断片が目的の断片よりも大きい位置に見えていて、バンドの濃さが目的のものよりも薄い場合、スター活性によって余計な箇所が切れてしまった可能性が高いです（目的断片よりも小さかったら、これは当てはまりません）。

あと、ライゲーションの手順等も詳しく書いていただけると、問題解決が早いかもしれません。

回答No.4

MIYD

No1さんの補足要求に追加して、
何クローン制限酵素処理して何個が目的のパターン以外
（もうひとつの断片が出てきている状態）
を示したのでしょうか。

比率やサンプル数が少ないのならばたまたまごみを拾っただけでしょうし、
ほとんど全てならばあなたの考えている制限酵素マップが間違っている可能性が高くなります。

回答No.3

geneticist12

＃１です

＞せめて、どういう末端のどれくらいの大きさの断片をどういうベクターに入れようとしたかという情報がほしいです。

あと、泳動で確認されたバンドについても

回答No.2

Sbacteria

質問の範囲内でわかる可能性は、
（１）ライゲーション時にNdeI/BamHIで切断される断片が一つ余分に入った。
（２）スター活性（特にBamHIはでやすい）
です。
　酵素を２種類使ったりすると、どうしてもグリセロール濃度が高くなりがちです。
第一化学から配布されているNEBの「制限酵素の基礎知識」（ただでもらえます）を参考にすると良いです。