PCRプライマーへの制限酵素配列付加

質問

こんにちは。いつもお世話になっています。

プライマー設計についてなのですが、
“制限酵素配列を付け加える場合は余分に数塩基追加した方が、制限酵素による切断効率が低下しない。”
というのを聞いたのですが、実際に全く余分な配列を付加しなかった場合とではどれくらい差があるのでしょうか。
もしくは、全く付加しなかったプライマーでのPCR productを制限酵素処理し、ベクターに導入した際の効率はかなり下がってしまうのでしょうか。

・・・というのも、大変お恥ずかしい話、今回PCR productをベクターに挿入する目的で制限酵素配列を付けたプライマーを設計したのですが、上記定義をプライマー作成後に聞き、もう一度作り直した方がいいのか悩んでおります。
基本中の基本のミスなのは重々承知の事なのですが、どなたかご存じの方がおられましたら、些細な事でも構いませんので教えて下さい。宜しくお願い致します。

回答No.3

geneticist12 · ベストアンサー

No. 2補足です

プライマーを注文しなおすのが心苦しいので、いまあるやつで何とかしたいというなら、

1. 二度手間ですが、PCR産物をTAクローニングか平滑末端クローニングして、プラスミドから目的の酵素で切り出す。

2. PCR産物をpoly nucleotide kineseとATPで末端リン酸化、ligationして重合させてから、目的の酵素で切る（これによって、ポリクローニングサイトの隣接するサイトを切るのと同等になる）。ただし、一方の切断によって切れ端が他方の末端についた場合でも必要な塩基数がまかなえない場合、効率が悪くなるとか、消化の順番が重要になるかもしれません。

お礼

なるほど！
打開策、ありがとうございます！！
TAクローニングしてそれから切る、という発想は全く思いつかなかったのでびっくりしました。
貴重なご意見、ありがとうございました。

回答No.2

geneticist12

Fermentasの情報が充実しています。
http://www.fermentas.com/techinfo/re/restrdigpcrii.htm

NEBも参考になりますが、polycloning siteの隣接するサイトの順次切断のデータなので酵素数が限られていますし、突出末端がある状態でのデータなので、PCR末端産物の末端に対してはあくまでも参考の域を出ません（と説明にもあります）。

考え方としては、
1. 6塩基以上余分につければどんな酵素でも大丈夫。
2. 参考資料がある場合は、最高ランクで切れる最小塩基数以上余分につける。

切断の判定は幅がありますので、中ランクや最低ランクだと、実用にたえないくらい切断高率が悪いと思ってよいです。

メジャーな酵素の多くは3塩基余分でたいていOK、0塩基で切れるものもあるかもしれませんが期待はできません。

回答No.1

nativepage

NEB社のHPに必要な足場の塩基数のリストがあります。
Base pairs from endのところが足場で、酵素によって必要な長さは様々です。
もし全く足場をつけていないのなら、設計しなおした方がいいと思います。
新しいのを注文したら、後学のために両方を制限酵素処理して比較してみるのもいいかもしれません。

http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/restriction_enzymes/cleavage_linearized_vector.asp

お礼

早々のご回答、ありがとうございました。
やはりそうですかね・・・。
少し気が引けるのですが、仰る通り、後学のためにも是非比較させて検討してみようと思います。