PCR産物4の制限酵素処理について

質問

ヒトの細胞からゲノムDNAを抽出し、PCRにて増やしたDNAを制限酵素処理しているのですが、上手くいきません。どなたかご指摘の方お願いします。

制限酵素名：KpnI
10×L buffer 1μL
PCR産物（フェノクロ処理、エタ沈、真空乾燥し滅菌水に溶かしたもの) 8μL
KpnI 1μL
反応時間：1時間

これで行っているのですが全く切れません。試しに一日置いたのですが、全く一緒でした。
ちなみにKpnIは別の人が、プラスミドを切るのに使って、成功したので、失活はないと考えられます。
また、PCR産物も確認したところ目的とするものでしたので、PCRは成功してます。

回答No.2

larme001

これだけの情報からすると正直原因がなにかとかは分かりずらいです。もしかしたら思わぬ凡ミス（16℃で反応させていたとか）あるかもしれませんし、なんとも言えません。

　とりあえず手技的なミスでないというなら、別のヒトが使っているPlasmidが残っていれば少しもらって全く同じ処理をして同時に流して確認するのがいいと思います。そちらでは上手くいくのに自分のサンプルがおかしいならやはりそのサンプルの何かが良くないのであってそれを検討します。

　PCR産物は確認したというのは、シーケンスを読んだということでしょうか？サイズであっているということなのか分かりませんが、まずは念のため自分の計画的におかしな部分が無いことを確認して下さい。ゲノムからなのであり得ませんが、過去に後輩が制限酵素が上手くいかないといってて結局制限酵素サイトの設計に決定的な間違いがあったということあります。そういう凡ミスを確認する意味でも、もう一度計画的に本当に切ることが可能か確認しましょう。

　それでも問題ないならやっぱりサンプルの状態の問題でしょう。たとえば純度、フェノールの持ち込みなどが多いと酵素反応を阻害します。一応念のためフェノクロの後はイソプロをやっているのですよね？DNAも風乾させすぎると難解性になることがありますが、そういうのはおそらく構造的にも変な形になってしまっていて結果切れなくなったりする可能性はあります。ちなみに、PCR産物なら、きちんと泳動してグラスピーズとかカラムのものを使って精製してから制限酵素に持ち込めばフェノールやクロホは不要ですし、エタ沈で不要な塩の持ち込みとかを考えなくてもいいともいます。反応系も10ulってのはエタノールの持ち込みとかが多少なりあった場合に、少しバッファーの濃度とかに誤差が出やすいので個人的には最低でも20～30ulの系でやりたいと思います。

　あとは、どうしても何故か上手くいかないということもあります。そういう場合は、手段の関係か好学のためにどうしても原因を究明したいとかなら別かも知れませが、あまりそういう基本的なことにこだわってもしょうがない（なぜか特定のケースでは”たまたま”上手くいかない場合はたまにある）ので、時間と手間の兼ね合いでいっそのこと別の方法をとってしまうというのも手でしょう。今後系を確立したい、とか頻繁に同様の問題が生じるなら問題でしょうが、目的によっては多少遠回りでも、原因不明の基本的な”ミス”？にこだわっててもらちが明かないなら別の方法で処理してしまった方が手っ取り早かったりしますしね。そのあたりは、時間とやる気と、その方法の妥当さと、自分のミスの可能性とかにもよるでしょうが。

回答No.1

otx

Kpn Iというか、L bufferで切る時に私が注意していることは,
エタノール沈殿で70%エタノールで行なうリンスをきっちりやることです。

L bufferは塩濃度が低いので、DNA溶液の含まれる塩の影響を受けやすいです。

あと、そのやり方でほかの思いつく可能性は、
基本的なこととしては、フェノクロでフェノールの除去をきっちりする
エタノール沈殿で出来たペレットは乾燥させすぎると液に溶けづらくなる
よって制限酵素がうまく作用しない

この２つはこじつけですが、参考までに。