ＴＯＰＯベクタ-に入っているcDNAを制限酵素配列付加プライマーを使っ

質問

ＴＯＰＯベクタ-に入っているcDNAを制限酵素配列付加プライマーを使ってＰＣＲで増やし、発現ベクターに入れたいのですが、色々と問題がありそうです。可能でしょうか？

遺伝子工学の初心者です。
2つ質問があります。どちらか一方だけでも良いので、回答よろしくお願いします。

(1)ＴＯＰＯベクタ-に入っているcDNAを制限酵素で切り出すのではなく制限酵素配列付加プライマーを使ってＰＣＲで増やし、発現ベクターに入れたいのですが、付加する制限酵素の配列がＴＯＰOベクターに存在してしまっています。この場合、非特異産物がでてきてしまうでしょうか？このような手法は一般的ではないのでしょうか？ちなみに、コザック配列をつけるため(制限酵素配列-コザック配列-5´端相補的配列)のプライマーで増やそうとしています。

(2)制限酵素の切断効率を上げるために制限酵素認識配列の両端に数塩基余分な配列を入れるとプロトコルにかいてあり、プライマーの5´端は入れようと思うのですが、制限酵素認識配列の3´側にも入れる必要があるでしょうか？
切断効率は制限酵素認識配列の両端にある塩基の数が重要で、どの塩基かはそれほど重要ではないとか、そんなことはないですか？

回答No.1

Drgorilla

１、PCRの特異性に効いてくるのはプライマーの3'側です。なので、あなたの場合問題ないでしょう。
２、3'側は続くDNAがあるので特に入れる必要はありません。