PCRの温度と時間

質問

早速質問させていただきます。

ＰＣＲをするとき、プレＰＣＲとポストＰＣＲをすると思いますが、（pre　denatureとpost elongationでしたっけ？）その反応温度と時間は何を基準に設定していますか？おそらくＤＮＡの長さや使う酵素によると思うのですが、いまいちどれくらいに設定したらいいのかが分かりません。酵素についてくる説明書の反応時間の例にも書いていません。
また、ＴＡクローニングでない場合ではDNAにＡを付加する必要がないのでpost elongationは必要ないのでしょうか？

回答No.2

Dr_Hyper · ベストアンサー

preの方は、denatureの意味と共に、hot start用の酵素をactiveにする意味があります。古典的な方法としては酵素をクロスリンクしておいて、熱を加えることで脱クロスリンクする場合や、酵素の特異抗体を用いて不活性型にしておき、抗体を熱で失活させて酵素を活性化する場合などがあります。一般には94-98℃で3-5min程度が一般的かと思います。この不活性化はサイクルが回るにつれてもどんどん活性化されていきますので、定量性などにシビアになる場合以外はそれほど気にする必要はありません。
postの方はサイクルの中では十分伸長しきっていないPCR産物を最後まで伸長させ、増幅されるはずの完全長を得るという意味があります。そのためlong PCRの場合には長めにとったりしますが、長すぎるとスメアになりやすい印象がありますので5-10min程度までが一般的な範囲だと思います。酵素によっては72℃よりも68℃を好む物もありますよ。
ご参考になりましたか？

お礼

っていうことはpre denatureはホットスタートでない場合は不用ということでしょうか？
postはAを付加する以外にもちゃんと必要なのですね。
丁寧な回答をありがとうございます。

回答No.1

otx

プレＰＣＲとポストＰＣＲとかあまり聞いたことがないので確認ですが、

例えば、

95℃　　　５分

95℃　　　３０秒
50℃　　　３０秒　　　　３０サイクル
72℃　　　１分

72℃　　　５分

こういう条件があるとして
どこの温度と時間のことをおっしゃっているのでしょうか？