pETによる発現ベクターの構築ができない？

質問

本当に困っています。どなたかよろしくお願いいたいます。

pCR4-TOPOに挿入されている遺伝子を制限酵素により切り出し、pET15b及び28aに挿入して発現ベクターを作ろうと思っているのですが、まったくうまくいきません。条件・症状としては以下の通りです。

(1)制限酵素はNdeIとXhoI（SingleとDoubleの両方でやってみたが×、Vectorは分からないがInsertとなるDNAは完全に切れていた、切ったDNAは電気泳動し、ゲル切り出しで精製）
(2)ライゲーションはTOYOBOのLigation Highを使用（16℃で1、3時間とovernight処理を行ったものを使ってみたが×、Vector:Insert比は1：1～1：3で行ったが×、直前にこれを使用して成功しているサンプルがある）
(3)トラホメ用セルはDH5αで行った（セルは購入&自作を使用、ヒートショック・KCM&PEGによる方法で行ったが×）
(4)生えたコロニーをコロニーPCRにかける（培地に問題はなし、インサートが入っている場合のバンドはもちろんのことなぜかセルフライゲーションの場合のバンドも出ない）

文字数の制限があるようなのでとりあえず書いてみました。説明不足名点は補足させていただきたいと思います。よろしくお願いいたします。

回答No.3

MIYD · ベストアンサー

>なぜかセルフライゲーションの場合のバンドも出ない

そこまでの文章からすると、生えてきたコロニーがセルフやインサート無しであることもまだ確認できていませんよね。
元のベクターはポジコンとして走らせているのでしょうか。

本当は取れているのに、
コロニーPCRがうまくいっていないだけのような気がします。
(生えているのが全部セルフであるという可能性もありますが)

ミニプレップしてみてはいかがですか。

お礼

回答ありがとうございます。

ポジコンも行ったのですが、ポジコンのコロニーPCRはうまくいっていることが確認できています。ポジコンのバンドより下にもやもやしたバンドのようなものがすべてのコロニーPCRで観察されたのですが、（最初はこれがセルフだと考えたのですが後にポジコンと異なっていたことから）未反応物ではないかと考えています（プライマー等）。よって抗生物質耐性はあるのにvectorは含んでいないなぞの大腸菌と考えていました。実はミニプレップを行い制限酵素処理して電気泳動も行ったのですが、大きさ的に明らかにおかしいと考えられるなぞのバンドが検出されてしまいました（大きさはさまざま、約1.5～3.0kbp）。

回答No.4

ebikichi

リガーゼの量を増やすと多少効率があがります。
時間を長くしてもバックが高くなるだけです。
vectorだけホスファターゼ処理も効果的ですね。

TA cloningはさんざんやりましたが、
効率が悪いときは、コロニーのpick-upをがむしゃらにやります。
ひどいときは５０個とって１個当たるかどうかなんてことも。

回答No.2

ebikichi

No1です
変なところに「？」が入ってしまいました。すみません。

回答No.1

ebikichi

NdeIはATGが使えて便利ですが、くっつき難いですよ。
平滑末端のつもりでやってみてください。

＞Vectorは分からないがInsertとなるDNAは完全に切れていた

vectorが切れるかの確認は必要です？全配列を検索してください。

お礼

回答ありがとうございます。

具体的にはどのような処理が必要なのでしょうか？ライゲーションの反応時間を伸ばすこと以外に何かあるのでしょうか？アルカリフォスファターゼ処理でしょうか？

補足

申し訳ありません。言葉足らずでした。

Vectorで切り出される部分があまりにも短いので電気泳動では違いが分からないという意味でした。制限酵素サイトは確認しております。