PCRの難しさ

質問

どう表現したらいいか分からないのですが、DNAにタグや制限酵素サイトを付けるためにPCRを行いますが、DNAの中にプライマーが収まるPCRより難しいでしょうか？
前後のプライマーが長いと難しそうですが。

図を入れたら分かると思うんですが、
図のここで図をいれ方が分かりません。

回答No.6

geneticist12

品質チェックは、HPLC, PAGE, MASSなどで、分子量があっているか、分子量が異なる副産物の混入は許容できるレベルかということしか見ません。そういうチェックすらしていない会社もあります。

できあがったものの配列が正しいかどうかは、調べる方法がありませんし、あったとしてもコストと時間がかかりすぎて商売にならないでしょう。

どこが良くてどこがあまり良くないかということはこういう場では言えませんが、どこに頼むにしろ高品質オリゴ、ロングオリゴを注文するときは、PEGE精製のオプションは必須でしょう。ふつうのPCRグレード（脱塩のみ）は論外、HPLC精製でも不十分です。

塩基当たりの単価だけ見て安いところを選ぶと、必要な精製が別料金のオプションになっていたり、最低品質保証が低かったりしますので、注意です。

お礼

結構いいやつを注文しました。
エラーがあるかもしれないですね。
アニーリング部分一つでもエラーがあったら
アニールしないんですか？
PCRがかかりにくいので何回かに分けてPCRを行うということなんでしょうかね？

回答No.5

Chicago243

100ぐらいだと流石になにがおこるか、、、
といった感じもしますが、まずPCRの変性の時の温度を98度にして、長めに取る方がいいかと思いました。

プライマーは長いと確かに品質(グレード)を上げた方がいいかと思います。PAGEで精製したグレードのオリゴをたいていの会社が扱っています(ちょっと高いですが)。PAGEで精製するのは手持のすでに購入済みのオリゴを自分で精製する手もあるでしょう。
確かTAKARAが1kbpぐらいのDNAを99%(何をもって99%かは突詰めて聞いたのですが、説明する人が把握していなかったのですが)以上の精度で作っているという話をしていました、いちど話を聞いてみてもいいかもしれませんね。

私ならそれぐらい長いタグをつける時はネスティッドPCRを選択肢として考えます。2回のPCRで徐々にタグを広げていく方法です。最初に22-25テンプレートとオーバーラップした60merぐらいタグ付プライマーでPCRしさらにそのプロダクトの末端とオーバーラップするタグつきプライマーを作りPCRといった具合です。2回目のPCRは今ある100merのプライマーが使えるかもしれません。
一回目のPCRは最初25サイクルぐらいでかかることを確認しておいて、実際は10-15サイクルぐらいの増幅したものを2回目のテンプレートとして使うといいと思います。それのほうがPCRによるエラーを避けることができますから。
配列のチェックはどこまでしているかはメーカーによって違いますが、シーケンスはしていないと思います。PAGEで長さをチェックしているか、MASSを使って分子量が理論値のものがどれだけあるかをチェックしているところもあります。あと間違えるとすればチューブの中身とラベルの表示したものとちがうといったところでしょうか。

回答No.4

geneticist12

>100bpくらいです。苦労しています。

でしたら、そのプライマーで少な目のサイクルでPCRして、その一部をとって、最初のプライマーの5'側の配列の適当な長さの配列でPCRをかけると良いと思います。

オーバーラップするDNA断片をつなげたDNAをとるとき、断片同士のみでPCRをかけて（それぞれの断片が互いにプライマー、鋳型として合成がおこる）、次に両末端のプライマーでPCRをかけて、うまくつながったものを増幅するのと同じ要領です。

100 bpの合成オリゴとなると、品質の高いものを求める必要があると思います（メーカによっても技術や品質管理のレベルが違います）。1塩基合成ごとに数パーセントのエラーがあるものですが、100 bpもの長さになると、全長正確な配列の分子はかなり少なくなります。プラーマーの配列がdegenerateしていればPCRはかかりにくくなるでしょう。

＞オリジナルの鋳型DNAは最後まで残ってPCRに関係するんじゃなかったですかね。

一般論ですが、新しく合成されるDNAが増幅していくので、オリジナルの鋳型の割合、そして鋳型としての貢献度は、サイクルごとに小さくなって行きます。プライマーにタグをつけたため、オリジナルの鋳型より新しく合成されたDNAのほうがより鋳型として適している場合ならなおさらです。

お礼

グライナージャパンというメーカーをご存じですか？
ちゃんとしたものを送ってきているかどうか
疑問なんですが。
配列をチェックしているんでしょうかね

回答No.3

geneticist12

ちょっとしたタグや制限酵素サイトくらいなら、ふつうのPCRに比べて特別に難しいことはないです。

考えてみてください。プライマーが鋳型からはみ出すのは、最初に入れたオリジナルの鋳型DNAを使って合成された場合だけです。

新たに合成されたDNAの末端は、余分の配列も含むプライマーの配列になります。そのDNAがまた鋳型として使われるわけですが、これに対しては余分な配列を含むプライマーもperfect matchですから、ふつうのPCRと変わりません。

お礼

最初さえうまくいけばいいんでしょうね。
それがなかなかうまくいかないのですが。
オリジナルの鋳型DNAは最後まで残ってPCRに関係するんじゃなかったですかね。

回答No.2

Chicago243

>PCRより難しいでしょうか？
タグや制限酵素サイトを付けたから難しいということはあまりないと思います。かからない時はプライマーのデザインをかえるのがたいていです。

ひとついえることは、タグなどを入れるとプライマーは長くなりますが、テンプレートとアニーリングする長さはそんなに長くない(場合によっては20mer前後)だと思うので、アニーリング温度を初めの数サイクルは50度ぐらいにして、そのあとアニーリング温度を上げるような工夫がいるかもしれません。裏技として、片方だけのプライマーで数サイクルPCRをかけそのあともう一方のプライマーを入れてPCRをするというのをする人がいます。長いとプライマー同士のミスアニーリングの可能せいも増えますから、、、でも私はそれはやったことがないですし、どこまで有効か分かりません。
基本的に私の場合はプライマーのデザインを変えますが、その前に違うメーカーの酵素をためします。KODは癖があって私はあまり使いませんが、これは好みだと思います。特にKODはベタインをいれると解決することが多いような気がします。
違うメーカーの酵素といいましたが、これは単なる酵素の性質というのもあると思いますが、各社PCRがかかりやすいように添付バッファーに工夫が凝らしてあるので、同じ酵素で何か添加したりということと同じようなことをやっているという感覚があります。そう言ういみで、私は手持のメーカーの酵素を比較するだけであまり条件には深入りしません。

お礼

回答ありがとうございます。
プライマーのデザインはどのようにするのが理想なんですか？
短いプライマーだったら簡単なんですが。
今回は100bp以上と長いんです。

回答No.1

happy-engawa

特に難しいことはないですよ。
タグが非常に長い場合(例えば、５０から１００ｂｐなど)は、難しいこともあります。

お礼

100bpくらいです。苦労しています。