制限酵素処理ができません

質問

限酵素処理を行いましたが、ベクターは確認できましたが、目的のDNA断片が確認できませんでした。制限酵素の量を多くしたり、オーバーナイトで反応したりさせましたが、無理でした。しかし、PCRを行ったところ、目的のDNA断片の存在を確認できました。初めに制限酵素処理で確認できなかったのはなぜですか？

回答No.3

cooh · ベストアンサー

まず、制限酵素処理に用いるbufferや温度が正しいことを再確認してから、No.1さんの回答のように、
1. インサートを挟む制限酵素AとB
2. 制限酵素Aのみ
3. 制限酵素Bのみ
の三種類で処理を行うことをおすすめします。
電気泳動するときには、
4.制限酵素処理していないもの
を同じ量だけ隣に流すとわかりやすいです。

質問文から思ったのですが、インサートがベクターと同じ長さであるという可能性はありませんか？その場合、2.と3.が1.の倍の長さに出てくるのでわかると思います。

回答No.4

isseifubisepia

他の人にもらったベクターの場合、ベクターのマルチクローニングサイトが、本来のベクターのものと変わっていてもわからないことがあります。つまり、ベクターの入れ替えなどを頻繁に行っている場合です。
　インサートがもしcDNAだったら、UTRに認識配列のある制限酵素を使ってみたらどうですか。

回答No.2

shimuraushiro

インサートが薄くてアガロースゲルで見えなかった可能性はないでしょうか。エチブロ処理を長めにすればうっすらでも見えないでしょうか。

補足

何回かやってみたのですが薄くも見えませんでした。見えないほど薄かったのでしょうか。

回答No.1

nitscape

制限酵素はきちんと目的遺伝子を切り出せる種類のものですか？
1カットのみの制限酵素で処理して流したらベクターのみの位置よりも大きいところにバンドが出ますか？

補足

ベクター内には同じ制限酵素で切れるサイトはありませんでした。１カットでの確認は行っていないのでやってみます。