Western Blot 数値化について

質問

研究でWestern Blotを行うことになりました。
専門分野でないため、実験で利用している先輩などもおらず、どうにかやっている状況なのですが、データの解析方法がいまいちよく理解できないので、質問させていただきました。
ほとんど、無知なため、書いている内容などが食い違う部分や、不明な点とうあると思いますが、ご指摘いただければと思います。ご了承ください。

現状ですが、練習して化学発光でバンドを出し撮影するところまでは出来ています。いろいろよんでImage Jで山を作って面積を求めたり、濃さを測定したり・・・ありますが、実際どの方法を取るのがよいのでしょうか？目的によって変わるものでしょうか？

実際、Westernのデータは私の研究では裏付けデータとして利用したいと考えています。
そこまで細かくなくても、ある程度の値が出せれば・・・と思うのですが、その場合、電気泳動時に何か既知のものを一緒に流したりするのでしょうか？
そのあたりが全く分からなくて困っています。

勉強不足で申し訳ありませんが、回答よろしくお願いします。

回答No.1

thaliana

Westernで何を調べようとしているのかにもよりますが、まず、そのバンドが検出したい目的のものかどうかを確認する必要があります。
例えば、１次抗体のあるなしで、そのバンドが２次抗体による非特異バンドではないことを確認できます。
１次抗体を加えた時だけに見えるバンドであっても、１次抗体による非特異バンドの可能性はありますが、目的の遺伝子をノックダウン等したサンプルがあれば、そのサンプルと比較することで、検証することは可能です。
分子量マーカーを一緒に流すことで、バンドのおおよその分子量が推定できますので、目的のタンパク質に見合ったものかどうかも確認する必要があります。翻訳後修飾がある場合は、バンドの位置が予想より大きめにでたり小さめにでたりするので、注意が必要かもしれません。