ウエスタンブロットのトラブルシューティングについて

質問

今、細胞内のICAM1の発現を確認するための実験をウエスタンブロット法で取り組んでいるのですが、中々うまくいきません。
抗体の種類や抗体の希釈率、希釈液の種類、転写時間、洗いの時間など色々やりましたが、いずれも非特異的なバンドがズラっと出てきてしまいます。バックグランドはきれいなので、サンプルの量が多いのではと思っているのですが、どのくらいサンプルの量を減らせばいいのか分かりません。こういう場合、ゲル染色（銀染色？あるいはCBB染色？）でサンプル内のICAM1の含有量を測定すると聞いたのですが、本当にゲル染色をする必要があるのでしょうか。

回答No.4

sirouto1gou · ベストアンサー

今日は。

サンタクルズの抗体は他社のそれと比較してワークしない場合が多い様に感じます。

現在、サンタクルズの国内販売元は東洋紡、コスモバイオ、ナカライテスク、岩井化学だと思いますので、業者さんに聞いて販売元に問い合わせるのも一つの手かと思います。

事情を説明すると対応してくれるかもしれませんよ。

お礼

そうなんですか！？知りませんでした。。。サンタクルズに問い合わせてみます。
一応、次にうまくいかなかったら、abcamの抗体を用いたいと思っていたのですが、abcamはどうなのでしょうか。

回答No.6

yukiti2go

ICAM1に対するモノクローナル抗体はないですか？
モノクロならたとえCBBでたくさんバンドが出ていてもウエスタンブロッティングでは一本のバンドが見られると思います
非特異のバンドがでるというのは、もしかしたら一次抗体、あるいは二次抗体が多いのかもしれません。

ゲル中の蛋白含量を計れるというのはうちの研究室ではやったこともないですし、勉強不足のためわかりません。
すいません。

回答No.5

sirouto1gou

再びNo.4です。

お問い合わせはサンタクルズではなく、国内輸入元に問い合わせをした方が対応は早いと思いますよ。
(その理由として直接問い合わせを行いますと結局それを輸入元に言って下さいなどの返答になるからです)

業者さんがどちらに注文しているか分かりませんので、まず業者さんに注文先を聞いて頂いた上か、もしくは業者さんに直接輸入元に問い合わせて頂くか、です。

昔からサンタクルズは開発力は高く、新しい抗体を作成するスピードは早いのですが、何分...なもので...

そのためにlot違いを請求する事も可能なはずです。

Abcamについてもそれほど変わりません。ただ、こちらですと日本法人がありますのでタイムラグはサンタクルズ程はかからないかと思います。

お礼

ご返答ありがとうございます。
それでは、輸入元に問い合わせてみます。

回答No.3

oil-sour

２次抗体はどんなものを使っていますか？　２次抗体がその非特異なバンドを構成するタンパク質に直接結合する可能性は？　（あまりないと思いますが・・・）

その「非特異的な」というのは何を持って非特異的と仰っているのでしょうか。目的とする分子量とは異なる位置に、はっきりしたバンドが複数現れるのですか？
その場合、目的とするタンパク質のバリアントや、分解産物という可能性は？　実験系にはプロテアーゼは混入していないでしょうか。プロテアーゼインヒビターは使っておられるでしょうか。

お礼

二次抗体は他のタンパクを見る際にも使っているものなので、おそらく問題ないとは思います。
また、プロテアーゼインヒビターはもちろん使用しています。

回答No.2

Dr_Hyper

1点確認です。
使われている抗体はウエスタンが出来る抗体ですか？
フローサイトが出来るからと言ってwesternが必ず出来るとは限りませんので、注意してくださいね。
特に膜タンパク質は抗体の用途が目的によってかなり異なりますから。

お礼

サンタクルズ社のICAM1のウエスタンブロットができる抗体を使っています。希釈している液がダメなのでしょうか？
一応、スキムミルクやBSA/PBSTなどを試したのですが。

回答No.1

noname#66086

こんにちは。

サンプルの濃度を適当にふってみてはいかがでしょう。
例えば、現在と同じ濃度、1/2希釈、1/4希釈など。

それでも、非特異的なバンドが消えないのであれば別の原因ということも考えられます。

お礼

ご回答、ありがとうございます！
早速、ふって実験をやってみたいと思います！