ウェスタンブロットで発光時間が短い原因は？

質問

ウェスタンブロットで、発光試薬をかけて３～５分室温でインキュベートさせたあと、写真をとって検出しているのですが、発光時間が非常に短い気がします。

発光試薬は
・Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate
・ECL Advance
を使っていて、

Immobilon Westernを用いる際はインキュベート5分後に30秒～1分の露光時間で、
ECL Advanceを用いる際はインキュベート1分後に10秒～30秒の露光時間で写真をとっています。

両者とも、試薬を加えた後、それぞれ７分、3分も経とうものなら発光強度が極端に落ち、検出ができなくなってしまいます。

同じ研究室で同じ試薬を使っている人はそんなに早く発光が消失したりしないのですが、私が用いると上のような有様です。

原因としては何が考えられますでしょうか。

回答No.2

ga111 · ベストアンサー

あとは２次抗体の洗いが足りず、遊離の酵素によって分解されているとか、、、あと二回ほどさらに洗ってみては？

個人的にはそれほどないケースだと思います。支障がないようだったら、あと２倍くらいに２次抗体を希釈しても実験してみましょう。どんな場合でもバンドがよく見える限りは、失敗ではありません。

お礼

遊離の酵素ですね、なるほど。
今後、洗浄を二回増やして試してみます。

それでもだめでしたら、二次抗体の希釈率も変えて試してみます。

アドバイスありがとうございます。

回答No.3

otx

２次抗体は何をお使いでしょうか？

GEヘルスケアのものでしたら、
希釈は1/50000くらいが通常です。

あと検出は何を使っているのでしょうか？
機械とか、フィルムとかです。

まぁ、これらのこと以前に、
そもそも検出がしづらい，発現量が少ないものを
見ているのであれば、蛍光物質の絶対量が少ないからとか
あるかもしれません。

一度、他の人がやってるサンプルを使わせてもらって、
他の人のやってることが再現できるかやってみて
問題は何かを把握する必要があると思います。

お礼

ご回答ありがとうございます。

GE Healthcare
Jackson ImmunoResearch Laboratories
です。

当研究室ではウェスタンブロットをそこまでやらないので、機械というよりは単純なカメラのようなものしかありません。Amershamの手動でシャッターをスライドさせるカメラです。

フィルムは
FUJIFILMのインスタントB＆Wフィルム　FP-3000B　というものです。

二次抗体の希釈率に関しては確かに観察する抗体によって1/50000まで薄めるものも但し書きに書いてありますね。
1/4000では濃いのかもしれません。検討してみます。

回答No.1

ga111

HRP酵素の基質の分解が速いためだと思います。基質を入れたらすぐに(３０秒以内）露光すれば、なんとかなりそうな感じですが、、、。２次抗体の濃度が高すぎるなどの原因が考えられますね。

お礼

ご回答ありがとうございます。

まだウェスタンブロットの経験が浅いのでお聞きしたいのですが、基質の分解がここまで早いことはよくあることですか？

今はなんとか基質を添加したあとにすぐ写真をとるなどしていますが、タイミングを逃してしまい、何度か基質を添加する破目になったりして、安定しないので困っています。

２次抗体は希釈率1/4000で行っているので濃度は高くないと思っていたのですが、場合によってはもっと希釈率を薄めたりしますでしょうか。