ウエスタンブロットについて

質問

始めまして。
現在、ウエスタンブロットにより蛋白の検出を行っているのですが、うまくいきません。どなたかアドバイスをいただけませんか。。

human由来の抗体で、私のサンプルは違う動物種なのですが、抗原認識部位の相同性は97％でした。
内部標準の検出はうまくいくのですが、目的の蛋白の検出は何度条件を変えてやってみてもうまくいきません。
目的の分子量の部分には、非特異が多いのもあり、なかなかバンドが確認できません。しかし、一度だけ、非特異はあったものの発現量の比較も出来るほどのバンドが出たこともあります。
しかし、同じ条件で行ってもきれいなバンドはその一度だけしか見られていません。
非特異が多いので、二次抗体の希釈を変え、何度もやってみてはいるのですが、目的の蛋白は検出できていません。

現在、違う抗体を購入しようか検討中なのですが・・・。
まだ、同じ抗体でやってみる価値があるのかどうか、どなたかご助言いただけたらなと思います。よろしく願いいたします。

回答No.2

masuda_takao

抗体のロット依存的な変成も疑わしいところですが、内部標準が正しく検出できているとなるとその可能性は低そうですね。

　試料の方において、目的の蛋白質の含有率が著しく低い可能性はないのでしょうか？
　或いは、そのサンプルに抗原抗体反応を阻害する物質が含まれていたりとか。

　似た分子量のモノが沢山あり、その中に非特異的にくっつくものが多ければ、別の抗体で免疫沈降による前処理をさせてから、当該の蛋白質を拾うという手もありそうです。

　思いつきレベルで恐縮ですが、ホンのお節介まで。

回答No.1

MIYD

目的のタンパク質のサイズをよく分離出来る条件で泳動してみてはいかがでしょうか

補足

MIYDさん。ありがとうございます。

一応、目的の蛋白が30kDaなので、泳動・転写効率も悪くないのではないかと考えています。
うまくいかないのは抗原抗体反応のほうではないか、と私自身は考えてはいるのですが。。。
泳動の方に問題があることも考えられるのでしょうか？