膜タンパク質融解法について

質問

7回膜貫通型受容体の研究をしていて、細胞中よりこの受容体を可溶化してwestern blotをしようといろいろ試したのですが融解できていないのか全く上手くいきません。もし融解法を知ってるかたがいたら方法や試薬の濃度など教えてください。

回答No.3

TCA · ベストアンサー

以前扱っていた膜タンパクを可溶化した時には、Nonidet P-40とsodium deoxycholateが入ったバッファーを使いました。バンドが検出されないとの事ですので、目的のタンパク質自体が分解されている可能性があります。私はバッファーにプロテアーゼ阻害剤を添加し、細胞を回収する操作はすべて氷上で行い、回収したlysateは液体窒素で急速凍結してから-80℃で保存していました。このlysateと*3サンプルバッファーとを2:1で混合し、加熱処理した後に電気泳動します。
参考サイトの文献ではHEK293に対して同じような組成のバッファーが使われています。
Westernの検出はHRP標識の二次抗体を使ってECL法で行いました。ECLは検出までに時間が掛からず、感度が良いのでお勧めです。

参考URL：

http://www.jbc.org/cgi/content/full/277/8/6590

お礼

ありがとうございます。一度この論文と同じ方法で融解を試みてみます。

回答No.2

TCA

差し支えなければ、下記の点について補足をお願いいたします。
・どのような細胞をお使いですか？
・lysisに使用してうまくいかなかった界面活性剤は？
・Westernの検出方法は？（二次抗体など）
・陽性対照として他の膜タンパクの抗体で検出された事はありますか？

補足

細胞はHEK293で、受容体をトランスフェクトしました。
lysisに使用した界面活性剤は0.1％ＳＤＳと1％triton-Xです。検出法は1次抗体がマウスのモノクロで2次抗体がウサギのanti-マウスＩｇＧ抗体です。
対照はおいてません。融解法はシリンジで30回ほどピッペッティングしてそのまま２*サンプルバッファーとまぜてます。膜タンパクを扱うのが初めてなもので、、、

回答No.1

MIYD

もし予想される分子量よりもずっと上にバンド（スメア？）が検出されているのでしたら
アグリゲーションをおこしている可能性があります。
4*SDS sample bufferを入れた後でボイルしないで4℃O/NでSDS化すると改善されることがあります。

お礼

回答ありがとうございます。スメアとかではなく、全く検出されません。ＰＣＲをおこなって確認してものがあることは間違いなさそうなのですが、、、、なにか融解法でいい方法ありますか？？