western blotについて

質問

時間、手間がかかるwestern blotって難しい実験なんですか？
CBBより感度は良いようですが。
フィルムに焼くとき汚れ（バックグラウンド）がでてきて困っています。

回答No.7

pi3-kinase · ベストアンサー

検出試薬は何をお使いですか？多くの場合、
1液と2液があって、用事で混合して使うものが
多いと思いますが、これらをよく混合していますか？
ピペッティング等でよく混ぜないと、ムラになること
があるようです。
　あとは、二次抗体の希釈倍率が高すぎるとか？だいたい
5000倍から10000倍で使うことが多いと思います。
　洗いが不十分？Tweenの量を少なくしているとか、洗いの
回数とか。以外に重要なのが、洗い終わった後に、デカント
で洗浄液を捨てると思うのですが、これをできるだけきっちり
捨てて、次の洗いに移った方が、洗浄効率は上がります。洗う
とは言っても、要するにブロッキング液や抗体の限界希釈です
からね。
　あとは、Chicago243さんのおっしゃるとおり、ブロッキング液
を変えてみるくらいかな・・・。

お礼

検出試薬はECLを使っています。
1,2液を等量混ぜるんですが、
20ml近いので転倒混和で混ぜています。
ボルテックスをしたほうがいいんでしょうか？
抗体は1次が1000～2000倍、2次が3000倍としていますけど。
抗体を混ぜるときも転倒混和をしています。
抗体にボルテックスはいけないですよね？

また、洗浄液を捨てるとき、一番最後の方を
捨てるのが難しくないですか？
メンブレンが落ちる可能性がありますし。
かといって手で押さえることはできませんし。

Tweenは作り置きのTBSTとして使っているので
毎回同じのハズです。

回答No.8

Chicago243

綺麗にできたことはあるのでということなので、他の１次抗体ではOK何ですね。

１次抗体の濃度を下げて検出できそうならまずそこからと思いますが如何でしょう。ECLで反応させたあとは乾かない程度ですが余分なECLの液をきってから検出しないとバックが上がります。しばらくキムワイプのうえに乗せて液をきる人もいます。

あと、１次抗体が濁ってたりしている場合は遠心するとバックが減ることがあるようです。

バンドが検出できるようであれば、違う抗体を買うより、幾らか工夫して見えをよくするのがいいと思いますよ。

お礼

サンプルと抗体によっても変わってくるのでしょう。
恐らく実験自体はマニュアル通りやっているので
できていると思います。
ECL反応後の液を切るのやってみようと思います。

回答No.6

Chicago243

http://www.cosmobio.co.jp/catelog/catelog.asp

抗体百科(抗体カタログ)2006-2007 第２版
ここに
サンタクルーズ社 推奨プロトコール

が載っているみたいです。試薬やさんのカタログに標準プロトコールを書いてくれたりしているので最近は便利です。あとポジコンはおもちですか?

回答No.5

pi3-kinase

こんにちわ。
バンド自体が全くでていないということですが、サンプルは
細胞の可溶性画分でしょうか？まずは、実験自体が上手く行って
いることを確かめた方がよさそうです。トランスファーは上手く
いっているということですが、どのように判断されているのですか？
また、βアクチンなどの検出や、もし、同じラボでWBをやっている人が
いるのであれば、その人がうまく検出できているものをやってみるのも
いいのかもしれません。実験自体が、どこかでうまくいっていないの
に、抗体を新たに買ったりするのは勿体ないと思うのですが・・・
貧乏研究室出身なので、貧乏性が消えず、このようなアドバイスを
させていただきました。

お礼

バンド自体は出ますが、
バックグランドがたくさん出ます。
転写はマーカーを使って確認しています。
転写まではちゃんとできていると思います。
ウェスタンは抗体の濃度、種類によるので
ちゃんとできているのかもしれません。
うまくいっていないはずはないんですけど。
汚れ（バックグラウンド）が強いです。

綺麗にできたことはあるので
抗体の選び方などが問題なのかもしれませんね。

回答No.4

Chicago243

>再度ありがとうございます。
>抗体処理時間は1時間と固定していますが。

１時間ですか。それならあまりいじりようがないですね。
まずはブロッキングの試薬を少し上げて見てはどうですか?それでも余り変わらないようでしたら、抗体の濃度を下げる。それでも無理な場合はブロッキング試薬をかえる。
というところでしょうか。ムラが出るのは抗体が均一にめぐってないか、部分的に乾きかけている可能性はないですか?もし抗体を反応させる時の溶液の量が多くてもかまわないなら多めにするのがベターですただそうは行かない時もあるかと思います。
１度貴重な抗体だったので、0.5mlで抗体の反応をしたことがあります。その時、メンブレンのうえにパラフィルムをかぶせたことがあるのですが、どういうわけかむらのあるバックがでたことがあります。OHPフィルムを必要なサイズに切って使うと改善されました。

お礼

ウェスタンの標準的なプロトコールが載っている本はないのでしょうか？
人によりやり方が違うので、どれが正しいのか分かりません。
洗浄、抗体反応のやり方とかラボにより
使うものが違うので共通化は難しいでしょうけど。

ウェスタンはなかなか一筋縄ではいかない実験ですね。抗体関係は試行錯誤しかないんでしょうね。

回答No.3

Chicago243

>変えるのは抗体関係ですよね？

抗体の濃度、あるいは抗体自身, ブロッキング試薬(スキムミルク、BSAなど何種類かあるとおもいます)抗体で処理している時間も考慮の余地があるかと思います。

お礼

再度ありがとうございます。
抗体処理時間は1時間と固定していますが。

補足

フィルムに焼いたときにムラが消えません。
どうしたらよいでしょうか？

回答No.2

Chicago243

>洗浄が十分にできていないということもありますよ
>ね？
あるかもしれません。でも３回ぐらいTBST(PBST)で洗えば、それ以上洗って劇的に改善するかどうかと考えると、そんなに工夫するようなステップではなさそうだなと思えます。

>ノンスペとは何ですか？
目的以外のバンドが出てくる時

お礼

バンド自体がまったく出てきません。

TBST、TBSの洗浄方法は毎回同じ方法でいいんですよね？
変えるのは抗体関係ですよね？

回答No.1

Chicago243

系が確立していればそんなに難しくないです。たいていの場合は標準の方法でうまく行くと思います。特にトランスファーまでは。

あとは抗体次第です。
バックグランドがでているということですが、ノンスペではなさそうですね。同じ2次抗体で違う一次抗体を使ってもバックが出ますか?その場合は二次抗体が悪さしてます。バンドが十分に強く検出できていれば、二次抗体の濃度を下げるのはてだと思います。また、二次抗体処理時間を短くするのも有効かもしれません。ブロッキングの試薬と二次抗体の相性が悪いかもしれませんね。ブロッキングの試薬を変えてみるのも手でしょう。
あとバックグランドの対処するのにメンブレンを変える手があります。PVDFはバックグランドが高く出ることが多いのでニトロセルロースを使う人も多いようです。
一次抗体が悪さしている時も一緒の考え方で対処すれば良いと思います。
使う抗体によってバックグランド、などすべてが変わってきます。ですからウエスタンは抗体しだいと言えると思います

お礼

回答ありがとうございます。

トランスファーまではうまくいっていると思います。
抗体の希釈倍率、種類などはものによっては標準の方法だけでは対処できないのですね。
状況に応じて試行錯誤ということですね。
洗浄が十分にできていないということもありますよね？
抗体反応をどのようにするかを試行錯誤しなければ
ならないのですね。

＞バックグランドがでているということですが、ノンスペではなさそうですね。
ノンスペとは何ですか？

補足

ウェスタンは難しい実験なんですか？
メンブレンは慎重に扱う必要がありますが。