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ウェスタンブロットの検出で
題字の如くなのですが、HAタグをつけた融合タンパク質をサンプルに泳動後、ウェスタンブロットでanti-HA mouse IgGで検出するという実験を行いました。二次抗体はanti-mouse IgG HRP conjugatedです。 しかし、抗体処理後にアマシャム社のECLキットを用いて発色操作をしたところ、今まで何もなかったメンブレン上に茶色いバンドが出現しました。これは目的のタンパク質が多量に発現しているのだろうと思い、LAS-1000イメージアナライザーでバンドを検出しましたら、メンブレン上に見えていたバンドの位置に全くバンドが検出されませんでした。 怪しいところと言うと、抗体処理、あるいはブロッキングの段階が考えられますが、メンブレン上にバンドが見えるのに、それを読み取れなかったと言う経験をお持ちの方、いらっしゃいましたら考えられそうな原因を何でもいいので教えて下さい。お願いします。
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パーキンエルマーのECLキットでもタンパク量が多かったり、しばらく放っておくと茶色くなります。 HRPの量が多すぎてイメージアナライザーに持っていく前に 基質を全部食い尽くしたのだと思います。 (茶色は分解産物?) すばやくやるか、 (イメージアナライザーの中で液に漬けるなど) X線フィルムで焼くか 少なく載せたメンブレンを作り直すか してはいかがでしょうか。
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- Sbacteria
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>アマシャム社のECLキット 発光による検出ですね。 すると、最初の茶色い発色は何が原因なのでしょうね? 発色させるために、特別な試薬を使ったわけではないのですね。??? 今の段階では、(1)発光系に問題が無い事 と (2)発光検出系(LAS-1000)に問題が無いこと の2点をしっかりおさえておく必要がありますが、それはクリアーしていますか? 自身が無ければ、コントロール実験を行ってください。
お礼
またまたのアドバイスありがとうございます。 アマシャム社に問い合わせたところ、茶色いバンドが出現する等の原因は、二次抗体の濃度が高すぎる、つまり反応させ過ぎているため、HRPが消費されてしまった可能性が高いとの回答がありました。これに、原因を限定するわけではありませんが、可能性としては最も高いだろうと思われます。今までのところ、LAS-1000については問題が生じていませんが、発光系については確信が持てないので、ここを抑えておく必要があると思います。コントロール実験もあわせて行います。 いろいろとためになるアドバイスを頂き、ありがとうございました。
- Sbacteria
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>初めて一次抗体処理後のメンブレンにHRPをかけて、その後発色基質をかけると、メンブレン上に茶色いバンドが見えるのに、シグナルとしては読み取れないと言うことなのです ------ 使用している基質は何ですか?発色基質は、色として認識できるだけで、光らないと思います。LASにかける場合は、発光基質を最初からかけてやる必要があると思います。 何か、発色しながら光るような基質を使用されているのでしょうか? 理解不足ならすいません。
補足
アマシャム社のECLキットというウェスタンブロッティング用の検出試薬を用いています。 プロトコールはキット添付のものを使用しており、それに従って操作を行っています。ECL Advance/Plusの基質は詳細が記されていないので分かりませんが、ECLの方は過酸化塩がHRP標識二次抗体に分解されてできる過酸化イオンと、ルミノール及びエンハンサーが反応してアミノフタレイトが生じる時に発せられる蛍光を検出するようです。
- Sbacteria
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>とすると、現在使用しているHRPはもう駄目と言うことになりますね。新たに購入する必要がありそうですね。アドバイスありがとうございました。 いやいや、そうではなくて、PVDF膜(かな?)上で結合している抗体に結合したHRPを確認の為発色させたわけでしょう?そうすると、その抗体に結合した膜状のHRPは発色反応を触媒し終わってしまったので、次に発光基質をかけても、光らなくて当たり前ではないですか? と言うことです。こちらが、間違った解釈をしている可能性もあるのですが?違いってますか?
補足
メンブレン上のタンパク質に結合した一次抗体に、さらにHRP二次抗体を結合させて、発色させるわけですので、つまりメンブレン上に結合しているHRPに発色基質をかけた後で、さらに発色基質をかけてもHRPはターンオーバーしないので、新たにかけた発色基質を分解せず、結果的に発色がおこらないという理解で宜しいのでしょうか? 私の問題点とは少し違うように思いますが、私の場合、初めて一次抗体処理後のメンブレンにHRPをかけて、その後発色基質をかけると、メンブレン上に茶色いバンドが見えるのに、シグナルとしては読み取れないと言うことなのです。なので、HRPをかけたメンブレンに初めて発色基質をかけても光らないというところが問題です。
- Sbacteria
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HRPは、ターンオーバーしませんよ。つまり、1回反応すれば死にます。だから、基質と発色させる反応を行わせた時点で、もう活性がなくなっているのが原因だと思います。
お礼
とすると、現在使用しているHRPはもう駄目と言うことになりますね。新たに購入する必要がありそうですね。アドバイスありがとうございました。
お礼
なるほど、ということは二次抗体の希釈率がまだ高かったようですね。普段より薄めてメンブレンにかけてみます。ありがとうございました。 あと、付け足すと、イメージアナライザーで検出すると、メンブレンすら読み取れていないことがあります。(画面が真っ黒、あるいは真っ白)おそらく、この原因も二次抗体の希釈率にあるのかもしれません。