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酵素サイトの確認について
midiprep kitでプラスミドを精製して、その後目的のインサートが ちゃんと入ってるか酵素で切って確認したのですが、なぜか酵素で 切れなくなりました。minipirepでプラスミドを精製した時は切れて いたのですが、その後midiprepで精製して、miniprepの時と同じ 酵素を使っても切れませんでした。どうしてこういうことがおこるので しょうか？また、酵素で切れない時はどうやってインサートを確認 したらよいのでしょうか？シーケンス以外に確認できるやり方って ありますかねえ。。。 ちなみに酵素は、Kpn1と BamH1を使って切りました。
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それは十中八九、アルカリ変性が過剰だったからでしょう。 スケールが大きくなった分、液の混合に手間取ったとか、温度や時間のコントロールがおろそかになったとかで、アルカリ/SDS液（solution IIでしたっけ）の処理が過剰になっていませんか？ アルカリでゲノムDNAを一本鎖に変性するが、スーパーコイルしているプラスミドは変性しにくいということを利用しているわけですが、過度にアルカリ処理すると（高温とか長時間とか）プラスミドも変性します。スーパーコイルなのでなかなか完全な一本鎖にはなりにくいのですが、一部でも解離するとプラスミド全体の二重らせんにゆがみが生じて、いかなる制限酵素も効かなくなります。この変性は不可逆的で、もとに戻す方法はありません。 ＞酵素で切れない時はどうやってインサートを確認 したらよいのでしょうか？シーケンス以外に確認できるやり方って ありますかねえ。。 変性したプラスミドでもPCRの鋳型にはなるので、クローニングサイトをはさむプライマーでPCRして、インサート内部の制限酵素消化パターンを、minipirepで精製したプラスミドのそれと比較すれば同一性はとれると思います。
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- geneticist12
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＞細胞に導入してもちゃんとタンパク質を発現させるのでしょうか？ もしわかるようでしたら教えてください。 生きた細胞に導入されれば、複製系や修復系によってなおされると思います。 培養細胞にトランスフェクションしたときに、活性の違いがあるのか、あるとしたらどのくらい影響があるのか、ということは詳しくないのでわかりません。 少なくとも大腸菌を形質転換する上では、上記のように変性したプラスミドでも遜色ありません。
お礼
本当にご丁寧に教えて頂き有り難うございます。 すごく参考になりました。有り難うございました！！！
お礼
ご回答ありがとうございます！！サンプル数が多かったし、 アルカリ変性に時間をかけてしまったかもしれません。 PCRでインサートを確認すればいいのですね！！早速試して みます。ところで、このような制限酵素が効かないプラスミドは、 細胞に導入してもちゃんとタンパク質を発現させるのでしょうか？ もしわかるようでしたら教えてください。