プラスミドへのインサート長が予想と異なるのはなぜ

質問

大腸菌で発現タンパクをつくるため、クローニングしています。PCRで増幅後、2つの制限酵素でプラスミド、インサートともに切断し、ライゲーション、コンピテントセルへの組み込み後、プラスミド抽出してから制限酵素で切断して長さを確認するのですが、インサートと異なる長さのものしか取れません。なぜでしょうか？　たとえばインサート1kbなのに取れたものは1.2kbと0.9kbになっていました。　単なるコンタミネーションでしょうか？

回答No.4

geneticist12 · ベストアンサー

ご質問の疑問点を解決するなら、シークエンスをするのが一番です。たんぱく質発現が目的ということなので、いずれにせよシークエンスをして、変異の有無を確認する用意があるでしょうし。

PCR産物を電気泳動でチェックしたとき、バンドがbroadになっていると、長さの近い副産物が見分けられないことはあります。
身の回りの経験から、起こりそうなことをあげると、
１．全く関係のないDNAが増幅されて混入していた（大腸菌のゲノム由来とか）。
２．プライマーがPCR産物内部のゆるいホモロジー部分にアニールしてプライミングしていた（短い産物）。
３．PCR産物の末端が、内部にゆるいホモロジーをもつため、一本鎖のPCR産物がプライマーとして、別の鎖を鋳型にした合成が起こった（長い産物）。

プライマー設計に気をつけることはもちろんですが、PCR反応の条件が過剰（サイクル数が多すぎる、伸張時間が長すぎるなど）だとこのような問題が起こりやすくなるので、無理なく増幅できる条件設定をするのが無難です。

回答No.6

ysar

研究室によって異なると思いますが、インサート・プラスミド比は私の講座ではng/bp比で10：1でやっています。しかし原因は多々あるので特定するのは難しそうですね。geneticist12さんの回答にありますように紫外線のあてすぎも考えられると思います。
他には例えばリガーゼは何回も融かして使うので最後のほうではかなり失活していたりとかも考えられます(私の場合どうもそれが原因で上手くいかないことがあったので）。
基本に立ち返るなら、操作の面で気をつける点は酵素はなるべく直前に使い激しく攪拌しない、よく混ぜる、コンピテントセルは温めたり衝撃を加えたりしない、あたりでしょうか。意外に人によってここの注意の度合いが違ったりしますので。

回答No.5

geneticist12

>形質転換後あまりコロニーが生えてこない場合が多いのですが

それだと、また別の可能性がでてきます。
PCR産物をゲルから切り出して使っているということですが、紫外線を当てすぎていませんか。
紫外線を当てすぎると、ピリミジンダイマーができます。これを組み込まれたプラスミドは、RecAホスト内では、修復が完了しないので、増殖不能になってしまいます。
通常なら問題にならないくらい低頻度の、環境中からのDNAのコンタミを拾ってしまったのが真相ではないでしょうか。

私は、長波長の紫外線源を使い、アルミ箔などで覆ってバンドの一部だけにあて、バンド位置に印をつけたら、可視光下で作業するようにしています。

補足

UVによる変性までは考慮していませんでした。試してみます。ありがとうございます。何度がやり直してみますが、良好な結果が得られていないので、もう一度プライマーから設計しなおしても見ます。

回答No.3

ysar

私もプラスミドに組み込んでから再切断で長さを確認する、というところがよく分かりません。そもそも、もしきちんと組み込まれているか確認するなら出来たプラスミドをシークエンスするのが一番確実で手っ取り早いと思うのですが。

補足

回答ありがとうございます。シークエンスするのが一番確実ですね。まずはシークエンスしてみます。設備の関係上シークエンサーが使えませんでした。次善の策としてプラスミド抽出してみたのですが、理解できない結果となりました。
話はかわりますが、形質転換後あまりコロニーが生えてこない場合が多いのですが、インサート：プラスミド比が適切でないということが影響しているのでしょうか。リガーゼ、コンピテントセルは市販のキットを利用しており、その部分での技術的ミスは少ないと思うのですが。

回答No.2

TCA

最初のPCRで目的のPCR産物以外に増幅されたものがあるのであれば、コンタミネーションしている可能性があります。電気泳動でPCR産物の純度を確認されていますでしょうか。
インサート内部配列に特異的なプライマーをお持ちでしたら、トランスフォーメーション後に生えてきたコロニーをコロニーPCRでスクリーニングするのはいかがですか。

補足

回答ありがとうございます。PCRで確認するためプライマーを設計しようと思います。

回答No.1

methyl

[補足要求
]いろいろな可能性が考えられるのですが、ライゲーション前、制限酵素切断後のインサートは電気泳動で大きさを確認しているのでしょうか？

補足

早速回答いただきありがとうございます。
PCR産物、ライゲーション前の制限酵素処理後については電気泳動により長さを確認しており、目的の大きさになっています。他のバンドは見えておりません。
ゲルから切り出しをしておりインサートは目的どおりだと思っています。