pENTRベクター。コロニーPCRができず困っています

質問

こんにちは。インビトロジェンのpENTR/D-TOPOクローニングキットを使って実験しているものです。
Gatewayのエントリーベクターを作成すべく、pENTR/D-TOPOに2kbpのDNA フラグメント（PCR産物）を入れることを試みました。しかし、遺伝子を大腸菌にトランスフォームした後、出てきたコロニー30個を楊枝でつついてコロニーPCRをかけたところ、期待していたインサートのバンドが全く検出されませんでした。
がっかりしましたが、念のために同じ大腸菌を培養してそこからプラスミドを精製し、PCRをかけてみたところ、実はなんと2kbpフラグメントはかなり高い確率でpENTR/Dに入っていたのです。pENTRを使うとこの現象が必ず起き、困っています。
ちなみに、大腸菌DH5α、ベクターpGEM-Teasyの組み合わせで使用したときには、このような現象は起きませんでした。コロニーPCRはKOD',最初に９５度５分で処理しています。
精製したプラスミドではPCRはうまくいったのに、なぜコロニーPCRではダメだったのでしょうか？このような事を経験された方はいませんか？それはどのように改善されましたか？コロニーPCRができないと沢山のプラスミドを精製しなくてはいけないので不便しています。

回答No.1

ebikichi · ベストアンサー

pick-upはどのようにしてますか？大腸菌Nucreaseの失活は十分でしょうか？
私は面倒ですが大腸菌を別チューブにpickupした後、ボイルしその一部をとってテンプレートにしていました。

プライマーの組み合わせを変えてみては？
両方ともシークエンスプライマーにしてみるとか

ＫＯＤを使用する意味は？
Ｔａｑを使ってみては？

などかと思いますが、どうでしょうか、、、

お礼

ご教授ありがとうございます。助かります！

pick-upは爪楊枝で行い、PCR反応液（１５マイクロリッター）中で軽く振っています。
ボイルは試した事がありませんが、やってみます。この方がPCR効率はよいのでしょうか？
大腸菌Nucreaseの失活は考えていませんでしたので検討してみます。

プライマーの組み合わせは、あるものでは、インサート内部を２組、両方共シークエンスプライマーを１組試みました。
ＫＯＤダッシュは遺伝子を選ばず良く増えるので好んで使っていますが、次はＴａｑも使ってみたいと思います。

大腸菌DH5α/pGEM-Teasyの組み合わせでコロニーPCRを何年もやってきて問題なかったので、今になってなぜできないのか不思議ですが、Gatewayの系が使いたいので努力してみようと思います。

回答No.3

AthlonXP

#2です。
TOPOでもgatewayでもおかしなコロニーは必ず出てきます。
コンタミは完全に防ぐことはできないでしょうからね。
我々の体にも抗生物質耐性菌がいるかもしれません。

私はTOPOで出た大腸菌をミニプレップでプラスミドを取り出し
シークエンスを行っています。
PCRを行うのでエラーが起きる可能性がありますからね。
コロニーPCRはシークエンスを行う為に行っているのですか？

ボイルとはボイル法のことですか？

インビトロジェンは電話で聞かれたのですか？
対応は良かったですか？

お礼

お気にかけていただき、ありがとうございます。

＞TOPOでもgatewayでもおかしなコロニーは必ず出てきます。
そうですね、その通りです。
当方も１００パーセント当たりという事は期待していません。
それどころかTOPOは良く入るという印象があり、
すごい技術だと驚いています。

＞コロニーPCRはシークエンスを行う為に行っているのですか？
シークエンス前に、「当たりのコロニーの目星をつけておく」という目的です。
つまり、TOPOで出た大腸菌からミニプレップでプラスミドを取り出しますが、これをなるべく少ない数でやりたいのです。
ミニプレップに使用するカラムはそこそこお高くつくし、
数が多いと時間もかかる。
当方は一度に多くのコンストラクトをすることが多いので、
ミニプレップを６０本やらなくてはいけないか、それとも３０本で済むかは大きい。
そこで、ミニプレップ前に、
おそらく当たりであろうというコロニーを選んでおきたいのです。

＞ボイルとはボイル法のことですか？
はい、そうです。

＞インビトロジェンは電話で聞かれたのですか？
はい、電話で聞きました。

＞対応は良かったですか？
ええ、とても丁寧に答えていただきました。
電話口で即答できない部分は、
後に答えてくれて誠意ある対応でした。

私もコロニーPCRにこだわるよりも、
AthlonXPさんのように、
TOPOで出た大腸菌から直接ミニプレップでプラスミドを取り出し、
シークエンスを行った方が早いと思うようになりました。
なにせ、多くが当たりのコロニーでしたから。
ただ、原因が、TOPOのある種の癖なのか、
当方が使っている酵素か。いくつかのインサートか。原因不明の何かのせいなのか。
それを知ることができればTOPOを上手く使いこなせるのですが。
時間が許せば、もう少し調べてみる予定です。

お時間を割いて頂き感謝します。
お手数ですがぜひご教授ください。

補足

＞TOPOでもgatewayでもおかしなコロニーは必ず出てきます。
当方で拾ったコロニーの半数がおかしなコロニーだった場合がありましたが、
これは当方のインサートフラグメントの精製度のせいだと考えています。
pENTRにインサートを入れる際、
インサートフラグメントの濃度が薄い、
短いフラグメントのコンタミがあるかも？、
そんな条件で入れると当然のことながらおかしなコロニーが多い。
しかし、インサートフラグメントを用意する際に、最高の物を用意できないケースがありました。

そこで、「目的外のフラグメントを持つプラスミドが出来ていてもいいや、目的の物が一つでもあれば。コロニーPCRで変なのものは除外して、それらしい物だけミニプレしよう」。
こんな場合にコロニーPCRができればいいなと考えたのです。

回答No.2

AthlonXP

TOPOはほとんどポジが出ると思います。
空ベクターはほとんど出ないと思いますが。
培養してプラスミドを抽出してgatewayシステムに持ち込めばいいんじゃないでしょうか？
プラスミド抽出後電気泳動をすればインサートが入っているかどうかは分かると思います。

プライマーの設計、アニーリング温度は大丈夫ですか？
コロニーPCRができないことはないと思いますが。
インビトロジェンに聞いてみてはどうですかね？

お礼

ありがとうございます。
＞TOPOはほとんどポジが出ると思います。
そうですね、いくつかのコンストラクトでは、９割がポジでした。
だからコロニーPCRをせず、プラスミドを抽出してからPCRを行い、ポジを確認すればいいと、最近私も感じてきました。
ただ、物によっては半分しかポジが出ないこともあるので、
可能ならば、コロニーPCRができれば便利なんだけどなー、と。
＞プライマーの設計、アニーリング温度は大丈夫ですか？
大丈夫です。プラスミドを抽出後に行ったPCRではどれも十分にバンドが検出されました。
＞インビトロジェンに聞いてみてはどうですかね？
ありがとうございます。聞いてみました。会社ではコロニーPCRはちゃんとできるそうです。

コロニーPCRでは最初にボイルする事もやってみました。
すると、ボイルしない場合、１キロ以下の低分子量域に僅かに検出された目的以外の何本かのバンドが、
ボイルした場合にははっきりと検出されるようになりました。
でも、目的の２キロのバンドはダメでした。

他の酵素ではまだ手がまわっていません。
いや、こんなに拘らなくても、コロニーPCRをせず、プラスミドを抽出してからPCRを行いポジを確認すればいいだけのことですよね・・・。
ただ、大腸菌DH5α、ベクターpGEM-Teasyの組み合わせで使用したときには、このような現象は起きなかったのでどうしても納得いかなくて（涙）。
ご解答助かります。ありがとうございました。