mRNAのシークエンスについて

質問

私は哺乳類のある酵素のmRNAの配列を決定する実験をしています。
他種間で相同性の高いプライマーを使って一部の配列を読み、あとはRACE法で全長を読む予定です。
お聞きしたいのはそれぞれの断片を読む時のシークエンスの方法なのですが、私はダイレクトシークエンスで全部配列を読もうと思っているのですが、これは一度プラスミドに入れてから読むべきなのでしょうか。
読んだ論文ではプラスミドに入れて配列をよんでいるものがほとんどのように見受けられ、不安なのですが…
ちなみに実験の目的はin situのためのプローブづくりなので、
全長を読んだ後適当な大きさの断片をプラスミドに入れてプローブを作ろうと思っています。

遺伝子については初心者なので、的外れなことを書いているかもしれませんが、お教えいただければ幸いです。
よろしくお願いします。

回答No.1

geneticist12

PCR産物が非常に均質ならばdirect seqも良いのですが、RACEではなかなかそうはいきません。
1. reverse transcription で、3'端のprimingがheterogenousであったり、5'端がどこまで伸びているかがheterogenousである。

2. splice isoformや転写開始点の違うものが混在しているしている可能性がある。

heterogenousなPCR産物はdirect seqは困難ですね。
クローン化してPCR産物一分子由来のものを読むべきでしょうね。
どうせあとでプラスミドに入れるつもりなら、入れた後のスクリーニングやseqチェックなどが必要でしょうから、まずクローニングして複数クローンをseqするのが良いと思います。

お礼

なるほど、RACE法では非特異産物に悩まされるとちらっと本で読みましたが、多様な断片ができてしまってそれがシークエンスの邪魔をするわけですね。
そうなるとプラスミドに入れても特定するのが大変そうですが、
サイズである程度分けたらあとはいくつかクローンを読んでみるしかないんでしょうね。
納得です！早速のご回答、ありがとうございました。