酵素活性がない!?

質問

ある植物由来のタンパク（酵素）を大腸菌内で発現させて取り出し、酵素活性を測定したのですがまったくありませんでした。詳しい情報は以下の通りです。

遺伝子の鎖長：約800bp
使用したベクターDNAと大腸菌の組み合わせ：
(1)pQE30×M15[pREP4]
(2)pET26b(+)×BL21(DE3)
(3)pET32b(+)×BL21(DE3)
発現条件：
37℃で培養しO.D.600=約0.6のとき1mMになるようにIPTGを添加し、25℃で培養。

その後、タンパクを抽出し、Ni NTA Agaroseカラムで精製しました。SDS-PAGEによる確認でも目的タンパクが発現していること、精製ができていることを確認しています。活性測定はその種類の酵素では一般的に用いられている方法で行っているので問題はないと思われます。

どなたかよろしくお願いします。

回答No.3

MIYD · ベストアンサー

ORF中にミューテーションが入って活性のないタンパク質になっていませんか。

タグが酵素活性に影響を与えないことは確認されているのでしょうか。
文献上にある場合は、C、N末の位置もあっているのですか。

バクテリアに作らせるとリン酸化や糖鎖の付加などが起きないと思いますが、
活性にこのような修飾が必要ないことは確認されているのですか。

クルード(大腸菌のペレットをソニケーションしただけ)では活性が見られたのでしょうか。
その時点でないのでしたら、リフォールディングする必要があるか、もともと活性のないタンパク質が発現しているのではないでしょうか。

活性測定時にポジコンとなる活性のある酵素もいっしょにアッセイしていますか。
ないのでしたら"一般的に用いられている方法"がちゃんとできているかはどのようにして確認していますか。

回答No.2

noname#14952

ゲル濾過でどの分画にでてくるか確かめてみてはいかがでしょうか。以前、あるタンパクがなかなか可溶化できず、低培養温度、低IPTG濃度でなんとか一部可溶化したと思ったのですが、挙動がおかしいのでゲル濾過してみると、ほとんどが超高分子の会合体であったことが判明しました。溶けていても安心はできないようです。今回はNiのカラムで精製できているのでその時点ではだいじょうぶだったのかとも思いますが、その後で会合してしまったのかもしれませんし。

DTTなどの還元剤を使用できない精製系の場合、精製の途中で酸化によって不溶化したり性状が変わってしまうこともかなり多いのではないかと想像しています。

私が扱っていたものは、培養温度とIPTG濃度をさらに下げて、ようやく使えるものを少量得ることができました。でもタグを変えたりホストを変えたりといろいろやっても大腸菌ではうまくいかないケースも多いみたいですね。

お礼

御礼が遅くなって申し訳ありません。回答ありがとうございます。

可溶化したからといって使えるとは限らないのですね。ゲル濾過を行ってみたいと思います。そのほかにも参考になるアドバイスありがとうございます。

回答No.1

mizu_atsu

大腸菌の段階で発現しても活性がないのだとしたら
結晶化しているのではないでしょうか？？
だとしたら可溶化するなりして
再活性化させないと活性は戻らないと思いますが・・・
ただ精製は出来ているとのことなので
精製後可溶化できるならそれでもいいかもしれませんが。

お礼

アドバイスありがとうございます。

つまり『可溶化している』≠『活性を持つタンパクが得られた』ということでしょうか？可溶化しているタンパクでも変性、リフォールディングが必要という風に捉えればよいのでしょうか?

説明不足で大変申し訳なかったのですが、可溶化に関しては低培養温度、低IPTG濃度等によって非変性条件下でも可溶化することが確認できています。特にpET32b(+)ではTrxタグによって通常の発現条件下で可溶化できました。