PCR＆電気泳動について

質問

電気泳動について質問です。3種類のプラスミドDNAについて、同じプライマーを用いてPCRを行いました。このバンドを電気泳動してみたところ、2種類のプラスミドDNAに関してはクッキリと目的バン ドが出たのですが、残り1種類のプラスミドDNAの増幅産物にかんしては、薄い目的バンド➕スメアが観察されました。この原因として考えられるのは何でしょうか？自分が考えているのは、プライマーや酵素には問題がないと思うので(他2種類のプラスミドDNAのPCRはうまくいった。)、テンプレートのプラスミドDNAの精製度が低いと考えています。現にO.D値も1.72くらいだったので…。なので、プラスミドDNAの抽出からやり直そうかと考えています。
他に何か考えるべき要因があれば、ご教授お願いします！

回答No.1

noname#250373 · ベストアンサー

候補クローンが得られるようになって良かったですね^-^

この材料だけで考えられる原因としては

・プラスミドの精製度が悪い（塩などの混入、DNAの分解など）
・ハズレクローン
・PCRに持ち込んだプラスミド量が少なすぎた
・PCR試薬類をマスターミックスで調整したのでなければ、そのサンプルだけPCRミックスの調整不良

といったところでしょうか。

OD値はプラスミドの調整方法によって異なるので、1.72という値だけでは他の人は判断しづらいです。

場当たり的にここで質問していると、結果的にあなたの研究スピードが落ちますし、
研究者として成長しませんよ？
研究室の人と事前・事後のディスカッションを行ったり、
イラストレイテッドなどで勉強しておくことはとても大事です。
面倒と思うかも知れませんが、その方がずっと成功の近道になります。
頑張って下さい！

お礼

アドバイスありがとうございます。どうやら、コロニー採取の際に、いくつかのコロニーが混ざってしまっていたようです。そこでコロニーからやり直したら、うまくいきました。