SiRNAとプラスミドベクターとのライゲーション

質問

SiRNA（２本鎖のオリゴ）をプラスミドベクターに挿入しようと思ってます。
そこでライゲーションの方法ですが、普通にT4DNAリガーゼを使ってもできますでしょうか。
プラスミドはDNAですが、挿入するのはSiRNAなのです。
いかがでしょうか。

回答No.3

MIYD · ベストアンサー

RNAの場合は下に回答がありますので、
siRNAをコードするDNAだった場合について。

もしもオリゴDNAを自分で発注して、
アニールさせてインサートとして入れるのであれば、
通常のオリゴDNAは末端にリン酸基がついていないので、
(注文すれば有料でつけてくれますが)
そのままの状態で、
ベクター側をアルカリフォスファターゼ処理しているとライゲーションされません。

ベクター側を制限酵素処理後に、
アルカリフォスファターゼ処理しないで、
セルフライゲーションが出ないものを用意しておくか、
(スタッファーDNAが入っていないベクターの場合は特に注意が必要です)

インサート側をPNKなどでリン酸化する必要があります。

お礼

ありがとうございます。
5末側にリン酸基をつけたオリゴDNAを発注し、アニーリングしました。
ということは、アルフォス処理しなくてもいいですよね。

回答No.2

geneticist12

TAKARAほか、試薬会社のカタログを見ると出ているますがT4DNA ligaseにはDNAとRNAを結合する活性もあります。

RNAとハイブリッドになったプラスミドがレプリコンとして機能するかどうかはわかりません。E. coli DNA pol IにはわずかにRNAを鋳型にしてDNAを合成する活性もあるので、もしかしたらRNAをDNAに置換して機能的なプラスミドを生じるかもしれません。

お礼

ありがとうgぞあいます。
T4リガーゼを使用してライゲーションしてもよさそうですね。
これを使って、ライゲーションしてみます。

回答No.1

pi3-kinase

質問の意味が良く分からないのですが・・・。
恐らくshort hairpin RNAを産生するベクターを作る
という事でしょうか？RNAポリメラーゼが含まれたベクターに
目的配列(恐らく50ベース前後だと思いますが）を入れるんでした
ら、通常のライゲーション方法で大丈夫だと思います。

　もし、DNAベクターにRNAを入れようとしているのであれば、
それは分かりませんが、そもそも、その目的が分からないのですが。
例え、そのようなベクターを作れたとしても、大腸菌内で増幅され
ないような気がするのですが・・・。答えになってなかったら、ごめん
なさい。

お礼

ありがとうございます。
ウイルスベクターと相同組み替えさせるベクターを作る予定です。
目的配列は５０ベースもありません。
ライゲーション処理後、大腸菌にトランスフォーメーションしてもダメでしょうか？