複数のプラスミドとベクター 論文訳について
めんどくさい質問ですみません。現在以下の論文を学校の課題で読んでいます。
マテリアル＆メソッドの「遺伝子組換え」方法について記された部分なんですが・・・
自分は遺伝子操作を行ったことがないので、理論は分かっているつもりだったんですが、意味がくみとれませんでしたorz
概要を説明すると、「AFR」というタンパクを大腸菌にて大量発現するために、遺伝子「afr gene」を含む組換え遺伝子をつくっているところです。
プラスミドとベクターがこんがらがってます。
質問は
・用いられてるベクター pCRII-TOPO 、pET24a(＋) のちがいは？
・用いられてるプラスミドpPS18 、pA6Ch1、pA6Ch1HIS のちがいは？
・プラスミドに遺伝子を挿入したものをベクターとここではよんでいるのでしょうか？
全訳をかいていただく必要はないので、以上のことを読んでわかるひといたらお願いします。
The afr gene was amplified from genomic DNA (1 μg) of S. morlense S-30.7.5 by using the primers 5’-ATGAA(CT)CGCTGGGGACTGATCGGCGCGAGCACGAT-3’ and 5’-TCAAAGTCCCGTTTCGATCTCGAC-3’ derived from DNA sequences flanking the SMc04400 locus of the sequenced S. meliloti 1021 genome.
The PCR product was separated in a 1% (wt/vol) agarose gel from which it was purified by using a MinElute gel extraction kit (QIAGEN) and then cloned into the vector pCRII-TOPO to yield plasmid pPS18 containing the 1-kb afr gene.
Plasmid pPS18 was used as a template for subcloning afr into the expression vector pET24a(＋) (Novagen, Darmstadt, Germany) via the NdeI and BamHI restriction sites of the primers 5’-TCTGCAGAATTCGCCCATATGAATCGCTGGGGACTGATC-3’ and 5’-AGTGTGCTGGAATTC
GGATCCTCAAAGTCCCGTTTCGAT-3’ to yield plasmid pA6Ch1, which was transformed into E. coli BL21(DE3).
To provide AFR with a C-terminal His6tag, plasmid pPS18 and the primers 5’-TCTGCAGAATTCGCCCATATGAATCGCTGGGGACTGATC-3’ and 5’-GGATCCTCA(GTG)6AAGTCCCGTTTCGATCTCGGC-3’ were used to introduce the afr fusion into pET24a(＋), yielding plasmid pA6Ch1HIS for transformation into E. coli BL21(DE3).
All inserts of the expression plasmids were verified by DNA sequence analysis.
お礼
ありがとうございました。 制限酵素サイトマップはもっているのですが インサートをシーケンスするプライマー設計のため配列を知ることが出来たらと思ったのです。 invitrogenに問い合わせることにいたします。