3者ライゲーション

質問

３者ライゲーションでかなり苦戦しています。何か良い方法等ありましたら、ぜひアドバイスください。

ライゲーションキットはRapid DNA Laigation kit(ロシュ)を使用し、ベクター側をSacI/NotIで処理しています（AP処理済）。インサート一つ目はSacI/BlnIで、二つ目はBlnI/NotIサイトでのライゲーションです。すべてアガロースから切り出し、生成したものです。反応時間はまず、インサートのmixtureで16℃15min、ベクターを添加して24℃10minです。ベクター：インサートモル比を1：3：3で行ってみましたがコロニーが得られませんでした。
　ベクター、インサートの消化はEPにより確認済み。にもかかわらず、ベクターのセルフが多発。

回答No.6

AthlonXP

切り出しにUVを使わないキットがあります。
それを使ってみると効率が上がるとのことです。

切り出す際DNA量がいるのが欠点ですが。

参考URL：

http://www.funakoshi.co.jp/h_news/BDL/050214_BDL01i.php

回答No.5

geneticist12

壁を突破できたようで、よかったですね。

＞短い断片のほうがＵＶの影響を受けにくいものなのでしょうか？

ピリミジンダイマーがランダムに生じるとすると、DNA長に比例して、分子内のどこかにピリミジンダイマーができる可能性が高まります。レプリコンとして、どこか一箇所でもピリミジンダイマーがあると悪影響がでるので、そういうことになるのではないでしょうか。

回答No.4

momo22v

three piece ligation　やったことがあります。
そのときの方法です。
少し前のことなので、記憶があいまいな部分もあり、参考になるかどうか分かりませんが…

インサート二種類とベクターが１：１：１になるように調整してやりました。
制限酵素siteはEco/Bam/Xhoです。
T4ligaseを使用して、インサートとベクターを分けることはせず、三つとも同じmixtureに一度にいれて１６℃オーバーナイトで反応させました。
なかなかの確率であがっていたように思います。

お礼

geneticist12さん、 momo22vさん、アドバイス有難うございました。ＵＶの点に注意してベクターを再調整したところ、旨く入ったようです。（シークエンス確認はまだしていないので確定ではないですが。）ただ、ＤＮＡ断片の長さにより、ＵＶの影響に違いが有りそうな感じを受けましたが、短い断片のほうがＵＶの影響を受けにくいものなのでしょうか？何はともあれ、助かりました。有難うございました。

回答No.3

geneticist12

さらに補足です。
インサートだけのライゲーションのあとで泳動でチェックしたことはありますか。ライゲーション反応は結構早いですから、すでにとんでもなく多数のフラグメントが重合してしまっているかもしれません。場合によっては、その段階で目的の産物を切り出してつかうとか。
むしろ最初からベクターこみでやったほうがいいかもしれません。

お礼

ご丁寧な返答有難うございました。インサートだけのライゲーションのあとの泳導はしたことなかったです。最初からベクター込みでやったことはありますが、改善されませんでした。現段階では、UV照射でのピリミジンダイマーが原因の可能性が強いですね。ピリミジンダイマーが形成されていることが判る方法があればいいのですが・・・。とにかく、その辺に特に注意して再度ベクターの調製からやってみたいと思います。有難うございました。

回答No.2

geneticist12

UVがDNAに照射されると、たとえばTが並んでいるところで隣り合ったT同士が共有結合してしまうことがあります（チミンダイマー）。これを、鋳型に複製されると2塩基が、CだったかGだったか1塩基としてはたらき、フレームシフト変異の原因になったりします。生物にはダイマーを除去修復する機構があります。大腸菌では、この修復の過程でRecAが必要なのですが、宿主菌の多くはRecA-なので修復が完了できません。

回答No.1

geneticist12

すべてということは、ベクターもですか？
少量とって泳動しただけでは、切れ残りのcccとか、OCは見逃す可能性があります。ligation反応のときに、じつはno insertのプラスミドがコンタミしているのかも、
前にも書いたのですが、切り出しのときのUVでピリミジンダイマーができます。そうすると、切り出したDNAを泳動で確かめてOKで、ligationもうまくいっても、生えてきません。ここを気をつけるだけで、劇的に結果が違うことがありますです。
http://oshiete1.goo.ne.jp/kotaeru.php3?q=1385118

お礼

ご返答有難うございます。
ベクターもです。セルフが入る可能性はここで一番高くなると考え、シングルバンドが確認できるような濃度で泳導し、制限酵素による消化を、ついで過剰量を泳導して切れ残りのコンタミを確認しました。過剰量といってもウェルに乗る分なので果たしてソレで確認になったとは言いにくい面もありますが・・・。
　ピリミジンダイマーとはどのような状況になるのですか？知識不足でお恥ずかしいのですが、お答え宜しくお願いします。