ライゲーション

質問

はじめまして。DNAを使い始めて３ヶ月の者です。
目的のDNAをPCRで増幅しPCR産物をT4DNAライゲーション（bio rad)のキットを使ってライゲーションし、amp+のLB培地に播いています。ベクターはpcR2.1(invitrogen)です。
コロニーが少なく、カラーセレクションもしているのですが、ほとんど青色です。
質問の仕方がうまくなく申し訳ありませんが宜しくお願いいたします。

回答No.3

geneticist12 · ベストアンサー

同じラボで通常成功しているプロトコールで、難易度も高くなさそうな短いインサートですので、方法論的にこれといった問題はなさそうです。一つ気になるのは、PCR産物を精製せずにライゲーションするというところです。精製無しでうまくいくとは限りません。むしろそのほうが例外でしょう。副産物やプライマーダイマー、プライマーモノマーが混じっていると意図しないライゲーション産物を生じるので問題です。ゲルからの切り出し、カラムなどで精製すべきです。今回は、はずれのコロニーさえあまりでなかったということなので、別の問題だとは思いますが。

一番考えられるのは、経験が浅いということなので、「手」の問題でしょうか。おなじマニュアルにしたがってやっても、新人だとなぜかうまくできないことがあります。でもそのうちに、どこかを変えたわけでもないのに突然できたりします。これはもう、経験を積むしかないです。一度や二度の失敗で音を上げないで、何度でもやり直してください。ベテランと二人並んで、同じ実験をしてもらえる機会があると一番いいのですが。

まあ、新人のうちは失敗して当たり前と思って、繰り返しチャレンジしてください。科学の世界でなんと非科学的な、と思われるかもしれませんが、手技を体得するというのはそういうものです。

お礼

ありがとうございます。研修にいっているラボでは精製せずにライゲーションというながれのようです。参考書を読むとPCR産物の精製→ライゲーションとなっていたので、いつ行うのかなと思っていました。
一番は経験不足なのかもしれません。諦めず、繰り返しやっていきたいと思います。

回答No.2

noname#17364

こんにちは。
増幅産物の長さは？
また、バンドはばっちり見えますか？うすいですか？

PCRプロダクトそのままTAライゲーションだと、長いと入りにくいし、量が少ないと入りにくいです。
この場合、50ulの系でPCRして、エタ沈して10ulに溶かし、それの5ul位を使ってみると良いです。ご参考まで。

補足

ありがとうございます。
目的の長さは800bpです。
エタ沈してという事は、精製してからの方が良いのですね。
やってみます。

回答No.1

geneticist12

一口に、PCR産物のクローニングといっても、いろいろな方法があるのですが、pCRはTAクローニング法のようですので、それを念頭に書きます。

既製品のTAベクターなら、ベクターの問題は無いでしょう。ちゃんとできているTAベクターならセルフライゲーションもほとんど起こりません。コロニーが少なくほとんど青というのは、ごく低頻度におこるセルフライゲーションのみが生えてきたものと思われます。

PCRにつかった酵素は何ですか。TAクローニングをするにはproof-reading活性（まちがって取り込んだヌクレオチを取り除くexonuclease活性）の無い酵素（Taqなど）である必要があります。proof-reading活性のあるPfuやKODなどでは産物を直接使うことはできません。

PCR産物はどのように精製していますか。ゲルから切り出して精製しているなら、UVの当てすぎてDNAが不活性化してしまうことがあります。

もしよかったら、その辺のところもう少し詳しく、どのようにやっているか補足してください。

補足

お返事ありがとうございます。
PCRに使った酵素はExTaqです。それから、PCR産物は全量10μlで、電気泳動に5μl、残りをそのままライゲーションしています。そこのラボではこの方法のようです。参考書にかいてあるPCR産物の精製はおこなっていないのですが…。