制限酵素サイトの異なるライゲーションについて

質問

現在、あるベクターから別のベクターへ配列を移し替えようとしているのですが、ベクターとインサートの制限酵素サイトが合いません。ベクター側はEcoRIとBamHIで、インサート側はEcoRIとNotIで切り出したいと考えています。このような場合何かいい方法はありませんでしょうか？
現在考えているのはベクター、インサート共に両側を平滑化する方法なのですが、向きが決まらないことと、現在まで平滑末端でのライゲーションの経験がなく、研究室内でも成功率が低いので他にいい方法がないかと思っています。
もしくはインサート側をＰＣＲで増やすことも考えたのですが、プライマー作製の時間を考えると、平滑化したほうが手っ取り早いのではないかと思っています。
また、現在まではライゲーションによって環状ＤＮＡを作ることしか行ったことがないのですが、上記のような末端を持つもの同士をライゲーションした場合、EcoRIのみで結合した直鎖状のＤＮＡが出来るのでしょうか？もしそうなのであれば、その後末端を平滑化してさらにライゲーションするという方法もありますよね？
勉強不足で申し訳ありませんが、何かいい知恵をお持ちの方がいらっしゃいましたら拝借させていただけないでしょうか？

回答No.3

hiddenleaf

他のクローニングベクターに移し替えるのが楽ですかね。
研究室内を探せば意外と丁度良いベクターがあるかもしれません。
個人的には制限酵素サイト付与のプライマーを使ってPCRで増やすのが良いかと。
酵素の足場も忘れずに。
いまどき２日もあれば注文したのがくると思いますよ。
平滑化は楽にみえて確認とか色々面倒だし個人的にはあまりお勧めしません。

回答No.2

Drgorilla

ベクターをBamHI、インサートをNotIで切って、平滑化、それぞれをEcoRIで切り、ライゲーション。

回答No.1

noname#194289

属している研究室の人に聞けないのでしょうか。