遺伝子組換え

質問

ベクターは制限酵素で切断してインサートDNAを組み込むと思うのですが、制限酵素で切断したままのプラスミドは、ライゲーション反応で簡単に再結合してしまいますよね！そうすると組み換えられていないベクターが出来る割りあいが多くなるから、脱リン酸化してリガーゼがDNAに結合できるようにしますが、これは片方のDNAのみを再結合させるだけで、もう一方は大腸菌内で修復系酵素で修復されますよね。
リガ-ゼが修復するのは分かるのですが、大腸菌内で修復系酵素によって修復がどのようにされているのか分かりません。。。是非、教えて頂けたらと思い質問しました。
参考書などは、難しく書いてあります。初心者でも分かりやすい説明ですと、尚うれしいです！！

回答No.2

ikkame

補足です。
ほしいインサートDNAを得るために、まずそのDNAのプライマーをつくって、PCRで増やしてインサートDNAがえられますよね。それは、普通は、TOPO vectorなどのクローニングベクターにライゲーションします。そのときは、便利なもので、いちいち制限酵素を使わなくても、ほとんどベクターとインサートDNAを混ぜるだけでライゲーションできます。
　でも機能を解析するときなど、pIRES-hrGFP vectorなどの発現ベクターにインサートDNAを入れ替える必要があります。そのときに、No1のような方法が必要です。TOPO Vectorなどに入っているインサートDNAの横には、さまざまな制限酵素サイトが入っているvectorですので、これから入れようとしている発現ベクターの制限酵素のサイトを考慮して、インサートDNAの両脇を制限酵素で切るわけです。

あと大腸菌内で修復系酵素？とか難しいことは、わかりません。いつもわからずに、やっております。今は、Western blottingで大きな（200kDa位）の蛋白のバンドが出なくて、苦労しております。お互いがんばりましょう。

お礼

ありがとうごさいます★
遺伝子組換えとか、何だか原理とか難しいですよね！！実験に時間もかかるし・・・
でも大腸菌の修復系酵素の所が、もう少し知りたかったあ。
本当にお互いがんばりましょう。★☆

回答No.1

ikkame

ベクターを切断するときは、普通は、インサートDNAに合わせて、二つの制限酵素を使って切っておきますので、再結合しないです。もちろんインサートDNAは、そのベクターと同じ制限酵素で断端を切っていないと、ライゲーションできません。ベクターを一箇所で切る場合は、そのままにしておくと再結合してしまいますので、その後に、ベクターの断端をリン酸化（脱リン酸化？詳しいことは覚えていません）しておかなければなりません。