巨大プラスミドのクローニング

質問

目的遺伝子の含まれるDNAが巨大プラスミドなどの大きなDNAである場合に目的断片がクローニングされる確率が低くなるのはどうしてですか。また、そのような場合に目的断片がベクターに組み込まれる確率を上げるためにはどのような工夫をすればいいのですか。

回答No.2

Mr_Spock · ベストアンサー

ligationで新規にコンストラクトを作る場合ももちろんですが、intactのプラスミドであっても、サイズが大きくなるなるほど大腸菌に入りにくくなります。おおよそ10 kbを超える物はそれ以下のサイズのものより1～2オーダーは下がりますし、20～30 kbを超えるくらいになるとケミカルコンピーテントセルで形質転換体をえるのは非常に困難になります。

1. ケミカル法ではなくエレクトロポーレーション法（電気穿孔法）を使う。これが一番の解決方法でしょう。
2. ケミカル法でやるなら、性能の良いコンピーテントセルを使う（。大きなプラスミドが入りやすい系統（DH5など）を使う。

ligation反応の段階でも、インサートとベクターのサイズの兼ね合いで、適当な環状産物のできやすさが違うでしょうが、ここはあまり問題ではないと思います。サイズが小さい場合でも、目的の環状産物はそれほど大量にできているわけではなく、反応系全体から見るとごく微量です。それでもたくさん生えてくるのは、大腸菌に入りやすいからです。

ただし、DNA断片の調製にゲルからの切り出しをしている場合、UV照射が形質転換効率を下げます（チミン二量体ができて複製がブロックされるため）。長いDNAほど、鎖のどこかにチミン二量体がが生じる確率は高くなるのでより影響が大きいようです。切り出すバンドにUVを当てないように工夫しましょう。

お礼

分かりやすい回答ありがとうございました。

回答No.1

otx

読解力が悪いので・・・
簡単に言うと、

自分がクローニングしたいDNA断片の分子量が大きいとき、
ベクターにライゲーションして組み込んだ後、
大腸菌に導入してクローニングを試みるということは
難しいのはどうしてか？

ってことでしょうか？

つまり、ここで問題なのは、
自分がクローニングしたいDNA断片が大きいということでしょうか？

それとも、ベクターの分子量が大きいということでしょうか？

補足

言葉足らずですみません。自分がクローニングしたいDNA断片が大きい場合です。