RT-PCRについて

質問

抽出したRNAからRT-PCRでｃDNAを作成する際に、原核生物の場合はoligoーｄT　primerはpoli(A)-tail
が存在しないので、利用できないと書いてあったのですが、実際手違いで利用したところなぜかｍRNAを取り出すことができました。これはもしかしたらpoli(A)-tailが存在するかもしれないということなのでしょうか？
この理由について知りたいのですが、回答よろしくお願いします。

回答No.4

geneticist12

＞ゲノムDNAのコンタミを増幅した可能性を排除するにはとりだしたｍRNAをｃDNAにせずPCRをすればよいのでしょうか？

そうですね。これはRT-PCR実験のときは必ずとるべきコントロールです。

または、Adaptorつきのoligo-dTを使っているなら、目的の遺伝子特異的プライマーとアダプタープライマーの組み合わせで確かめるとか（つまりRACEです）。それでももし増えてくるなら、その産物をシークエンスしてなにが起こっているか確かめてください。
もしその結果が、原核生物のpoly-A付加の可能性を示すものなら、、、大発見です。

お礼

貴重なご意見ありがとうございました。参考にさせていただきます。ちょっとやる気がでてきました。

回答No.3

geneticist12

AT-richな配列にmis-annealして逆転写が始まる可能性はありますが、原核生物ではoligo-dT primerで逆転写が起こるとはないと考えていいと思います。

＞ｍRNAの確認として、cDNAに含まれていると考えられる配列をPCRで増幅させ、アガロースゲル電気泳動でバンドを確認しました。

ゲノムDNAのコンタミを増幅した可能性は排除できますか？　逆転写なしのnegative conrolの結果は？

補足

ゲノムDNAのコンタミを増幅した可能性を排除するにはとりだしたｍRNAをｃDNAにせずPCRをすればよいのでしょうか？

回答No.2

babanbabanbanban

「ｍRNAが取り出せた」というのはどうやって確認したのですか？
特定のｃDNAがPCRで検出できたということですか？

補足

ｍRNAの確認として、cDNAに含まれていると考えられる配列をPCRで増幅させ、アガロースゲル電気泳動でバンドを確認しました。

回答No.1

MIYD

数bp連続したAがあり、
そこにオリゴdTが結合したのではないでしょうか。
回収した配列を使って3'RACEはやりましたか？

それで本当にpolyA tailがあるのかが分かると思います。

補足

３’RACEはしていません。それについても検討して今後の実験に役立てたいと思います。回答どうもありがとうございました。