RT-PCRが上手くできないのですが

質問

RT-PCRでポジコン(GAPDH)を含めたバンドが検出されません。
RNAはキットの製品を使用し、OD260/OD280で2程度、電気泳動でRNAを確認しました。（poly-Aに精製してません）
cDNAの作成もキットで、Randam hexamer primerを使用しました。
PCRは論文に掲載されているprimerと条件で行いました。
cDNAが上手く出来ていないのかprimerがいけないと思うのですが、このような状態でどのような原因検索をしたらよいでしょうか？
また、primerはcDNAという1本鎖のDNAに対してでもsenseとanti-senseのペアーが必要なのはなぜでしょうか？

回答No.5

methyl · ベストアンサー

あ、laboの他の方が誰もRNA扱ってないってうのを思い出して
今ふと気にかかったんですが、DEPC水は大丈夫ですか？
ちゃんと臭わなくなるくらいまでオークレしてますか？？

お礼

確かにDEPC水は可能性があります。
蒸留水に終濃度が0.1%になるようにDEPCを加え、よく振り混ぜ、蓋を緩めて、室温でオーバーナイト放置、
その後、120℃ 40min、オートクレーブ滅菌しました。においは、いわゆる“滅菌したもののにおい”がややする感じです。無臭とは自信を持って言えないですが、微妙です。
今回の一連の流れでは、精製したTotalRNAの溶解ではじめてDEPC水が出てきます。そのRNAの電気泳動で先ほどの返答のごとくの結果でした。それでやや分解が進んでいるのかもしれませんね。また最終のPCRで使用したDEPC水はPCRする部屋で使用するもの（技官さんがつくってくれたもの）を用いたかも知れません。
もう一度検討してみます。（DEPC水が原因ならサンプルが全滅ですね）ありがとうございます。

回答No.4

methyl

cDNAができてるてるかは、やはりPCRでの確認が普通ですねえ。
GAPDHは非常に発現が高いのでその条件でnon-speバンドすら出ないとなると
あとは、RNAが分解しているかDNAが多量にコンタミしてるかのか。。
でも、ratのGAPDHって確かほとんどイントロンないんですよね？
RT(-)の結果はも全体が薄く染まってますか？それとも何にも見えませんか？
ちなみに、RNAを泳動確認したのは最近のことですか？
18Sと28Sは綺麗に見えてるんですよね？
あ、あとGenBankで確認されてるんでしたらBLASTは必要ないです。

お礼

RT（-）では全く何も写っていないので、何かは出来ていると考えた方がよいかもしれませんね。
また、RNAの電気泳動はPCRの結果が不良だったので順番が逆なのですが先週行いました。バンドが2本見え、分子量の少ないバンド群を確認いたしました。
ご指摘のようにRNAの分解が多いのかも知れません。後はDNAのコンタミも考慮してホットスタートの時間を長くするとか、アニリングの温度を気持ち下げてnon-speも含めて引っかかるようにいろいろ条件を変えてやってみます。
繰り返しご返答いただきまして、誠にありがとうございました。

回答No.3

methyl

いくつか原因が考えられると思うのですが、
とりあえず、
1. RTのKITはいつ購入しましたか？
2.Primer setが掲載されていた論文でtemplateとしていた動物や細胞は自分のものと同一ですか（例えば同じマウスでも系統は同じか等々）？また、PrimerをBLASTやEnsemblなどで投げて確認し直していますか？
3.PCRのannealing温度とサイクル数はいくつですか？
4.何ugのtotal RNAを反応させていますか？
5.GAPDHが検出できないというのは、何もbandが出ないのですか？それともnon-speのバンドのみなのですか？その場合、RT(-)の結果はどうですか？

いろいろありますが、
GAPDHが出ないとなると何巡なケアレスである可能性が高いとは思うのですが，，

補足

何度も申し訳ございません
1.RTのKitは昨年末に購入しております
2.Wistar ratで同じです。プライマーの塩基配列が正しいことはGenBankで確認しましたが、BLASTなどは確認しておりませんでした
3.アニリングは55度、合計35サイクルで、hot startです
4.説明書で必要量が10-5000ngでしたので、全て400ng位のtotal RNAを使用したことになると思います
5.全体的にゴーストのようにレーンが淡く染まっています。一部濃く見えそうな部分もあるのですが、同じ検体で違うプライマー（同じサンプルでGAPDHのプライマーと目的のプライマー）のレーンが全く同じに見えます

BLASTは早速あたってみます。あとcDNAが出来ているかどうかは調べる方法はあるでしょうか？

回答No.2

methyl

すいません、もちろんlabe→laboのミスタッチです。

あと、ついでにPCRは
片側だけですと一本のDNAが
2→3→4→5→・・・としか増えません。
両側だと
2→4→8→16→・・・ですよね。
とまあ、とにかく普通のPCRと同じことです。

回答No.1

methyl

RT-PCRはたしかにGAPDHまで出ないとなると厳しいですね。
まずは、あなたのlaboで他のRT-PCRやってる人はいますか？
いるなら、とりあえず逆転写酵素がへたってたり、
GAPDH primer（共用なら）という問題はクリアしてるわけですし。
他にも、PCRの条件も再検討する必要が有るかもしれません。
例えpaperに載っていた条件でも，
labeによってTaqが違ったりthermal cyclerの機種によって
同じ条件でもうまくいったりいかなかったりしますからね。

>primerはcDNAという1本鎖のDNAに対してでもsenseとanti-senseのペアーが必要なのはなぜでしょうか？

これはあまり質問の意図がつかめないのですが、
通常のPCRと同じことですよ。
片側だけだったら、
いろいろな大きさのフラグメントができていきますよね。。

補足

早速のご返答ありがとうございます。
当方のlaboではRT-PCRは今まで誰もしていないようです。通常のPCRをしている方に相談しながらの施行で困難を極めているのですが・・・。
Taqは他のPCRをした際に上手く出てたので今回は問題ないと思います。primerはGAPDHを含めて新しくしており、Taq以外では共用はないです。
先生方でしたら、この状況でどこから問題の検討をされるのでしょうか？
PCRの条件チェックやTaqの再検討は、RT-PCRではなく、通常のPCRをその種の動物検体（特にGAPDHをしようして）に行うことで検討が出来るかな、と思ってはいるのですが、いかがでしょうか？
他のcDNAの精製からPCRまで上手くいっているかの検討は未だ全く見当がつきません。

>primerはcDNAという1本鎖の・・・の部分はご説明をお聞きして、勘違いしていることに気づきました。ありがとうございます。