RT-PCRでのプライマー設計

質問

生命理工学部の三年生です。
RNA発現量をみるためにRTーPCRを使うのはわかるのですが、このときなぜプライマーの設計をイントロンをはさむようにしなければならないのかがわかりません。どなたかご教示お願いします。

回答No.1

Chicago243

cDNAでなくゲノムから増幅されるシグナルを抑えるためです。イントロンは非常に長いことが多いのでゲノムからのシグナルが得られないか、違う場所にバンドが現れるので区別することができるなどの利点があります。RT-PCRもリアルタイムかどうかで少し考え方が変わってきますが、基本的にはおなじです.cDNAを作る時あらかじめDNase処理をするのでその必要があるのかという疑問もあるでしょうが、以下のように考えられます。PCRは1コピーでも増幅可能です。ゲノムが1コピーも残らずDNaseで切られている保障はありません。例えばゲノムがあるサンプルは1コピー残っていてほかは2コピー残っていればベースラインが2倍違ってきます。イントロンをはさんでおくとプライマーではさんだ間のゲノムの長さが長くなるのでDNaseによる分解で生き残るゲノムの量も極端に落ちるのでコンタミを検出する確率も極端に落ちます。

あとRNA精製で、ゲノムのコンタミは避けられないものと考えてください。最近改善されたキットが出ているようですが、現状は把握していません。

お礼

ありがとうございました。これからも勉学に励んでいこうと思います。