RT-PCRトラブルシューティングとして

質問

こんにちわ。RT-PCRの初心者です。アドバイスを頂けたらと思います。
ある目的の遺伝子のｍRNAを抽出してｃDNA合成後、PCRで増幅してバンドを確認したいのですが、バンドが確認できません。
TRIZOLでの抽出及びキアゲン社のRNeasykitの両方で試しましたがうまくいきませんでした。OD260/280の値から見ると1.8-2.0で純度も悪くないと思います。そこから濃度計算しておよそ１μｇほどをテンプレートとしています。RTにはキアゲン社のOneStepRT-PCRを使っています。
そこからPCR後に泳動するとバンドが確認できません。（ポジコンのサンプルです）違うサンプルではバンドが出ていたのでプライマーやアニーリングには問題が無いと思います。泳動も問題ないと思います。
そうなると抽出か分解かになると思うのですが・・。
自身で考えられることはしましたが改善できませんでした。
何か考えられる問題点とアドバイスをいただけたらよろしくお願いいたします。

回答No.2

piyoco123

コンタミしてmRNAが切れてしまったのでは。
普通のtotal RNAの抽出は適当にやっても出来ますが、cDNAの増幅は結構気を遣います。
ターゲットの量も少ないし長いので。

回答No.1

MIYD

ポジコンではRT-PCRでバンドが増幅するが、
あるサンプルでは同じプライマーセットで増えないと言うことですか？

違うプライマーセットでもサンプルは増幅しないのですか？
そもそも、サンプルでそのRT-PCRが増える根拠はあるのですか？

TRIZOLということは、totalRNAですよね。
抽出後に泳動していないのであれば、
まずは泳動しましょう。
それで、分解しているかどうかは分かります。

ポジコンとサンプルは同時に抽出しているのでしょうか？
ポジコンも同時に抽出しているのでしたら、
抽出時にごみもいっしょに拾ってきたために酵素反応が阻害されているとは考えにくいです。

1.抽出→泳動して確認
2.RT反応→ポジコンとなるプライマーセット(actinなど)で増えるか確認
3.目的のPCR
で確認していけば、どの段階が問題なのか分かるかと思います。