mRNAにおける遺伝子の発現について

質問

遺伝子実験初心者です。
mRNAにおけるとある遺伝子の発現レベルを調べる実験を行おうとしています。
リアルタイムPCRを行える環境でないため、次のように実験を行おうと思っています。
RNAの抽出→RNA量の測定→RT-PCRでcDNAを作製→目的遺伝子のプライマー＆ハウスキーピング遺伝子のプライマーを用いてそれぞれPCRにて増幅→電気泳動にてバンドの濃さを確認。

Aの細胞集団(1×10の6乗個)から抽出したRNAと、Bの細胞集団(5×10の6乗個)から抽出したRNAにおける、とある遺伝子の発現を比較したいのですが、両細胞から抽出したRNAをAとBで同量になるようにして実験を行えば、正しい比較ができていると言えますか？

回答No.2

otx · ベストアンサー

なんか、参考のためのUTRを添付したら、ややこしいことになっているようなので、最初の回答を一応、書き直して書いておきます。

いわゆる半定量的RT-PCRというやつですね。

＞両細胞から抽出したRNAをAとBで同量になるようにして実験を行えば、正しい比較ができていると言えますか？

ただRNA量を同じにすれば良いかと言えば、それだけではダメです。
少なくとも、

・プラトーに達していない
・逆転写の効率などを確認するためにcDNA量の補正をハウスキーピング遺伝子量をPCRにて確認

などをする必要があります。
ここに書くと書きそびれなど、誤解を招く可能性があるので、
こちらの書籍を一読されるといいと思います。

秀潤社　バイオ実験イラストレイデット第３巻 新版本当に増えるPCR

また、その手法で実験を行なったものがありましたので、
以下のものを参考にされたらどうでしょうか。

googleで半定量的RT-PCRをキーワードにして検索をかけたときに
３番目にあるPDFファイル

お礼

ご丁寧にありがとうございます。
非常に分かりやすかったです！
参考のURLもありがとうございました。

回答No.1

otx

いわゆる半定量的RT-PCRというやつですね。

＞両細胞から抽出したRNAをAとBで同量になるようにして実験を行えば、正しい比較ができていると言えますか？

ただRNA量を同じにすれば良いかと言えば、それだけではダメです。
少なくとも、

・プラトーに達していない
・逆転写の効率などを確認するためにcDNA量の補正をハウスキーピング遺伝子量をPCRにて確認

などをする必要があります。
ここに書くと書きそびれなど、誤解を招く可能性があるので、
こちらの書籍を一読されるといいと思います。
http://www.shujunsha.co.jp/book/4-87962-/182-X.html

また、その手法で実験を行なったものがありましたので、
参考にされたらどうでしょうか。
http://air.lib.akita-u.ac.jp/dspace/bitstream/10295/1548/1/akigaku31-2f.pdf