RT-PCR法について

質問

たびたびすいません；
この方法はmRNAを元にして行ないますよね？
蛋白質に色々な操作を加え、ポリペプチド鎖(断片)のN末端C末端の配列を決定した後、PCR法だと、N末C末のアミノ酸配列を元にプライマーを作り・・・と、わかるのですが、mRNAを使うRT-PCR法はどのようにして行なうのですか？mRNAはどこから持ってくるんですか？

何度も質問してしまいすいませんが、回答のほうお願いします。

回答No.3

MIYD · ベストアンサー

元にするmRNAは目的の遺伝子を発現している細胞又は組織からとってきます。
通常はリボゾーマルRNAやトランスファーRNAも混ざっているトータルRNAを回収してくれば、RT-PCRにまで持っていくことが出来るかと思います。

mRNAには通常poly A tailと呼ばれるAが続いている配列が3'側にありますので、
Tが18個位続いているプライマー(oligo dT primerと呼ばれます)とmRNAを混ぜて、熱変性させた上で、温度を下げて結合させます。
この状態で、逆転写酵素反応を行うと、mRNAの相補鎖のDNA(complementaly DNA: cDNA)が出来ます。
逆転写酵素はRNA-dependant DNA polymeraseと呼んだほうがわかりやすいかもしれません。RNAを鋳型にして、DNA鎖を合成する酵素です。

3'UTRと呼ばれる、たんぱく質になる部分よりも下流側のDNA配列が長い場合などで、oligo dT primerでは目的の部分まで反応が進まない場合は、
A,T,G,Cがランダムに6個並んでいるrandom hexamerと呼ばれるプライマーを使う場合もあります。

こうして作製したcDNAを使って#1,2の方が書かれているようなdegenerate PCRを行い、
目的の遺伝子の配列を増幅します。

http://www.iam.u-tokyo.ac.jp/bnsikato/protocol/b9.html
http://www.iam.u-tokyo.ac.jp/bnsikato/protocol/c4.html

補足

とても分かりやすい説明をありがとうございます。
分からなかった部分がかなり理解できました。

PCR法とRT-PCR法では、元になるもの(DNAとmRNA)が違うので、分離精製したポリペプチド鎖がDNAかmRNAかによってどちらを使うかを決めるということでいいんですか？？

回答No.4

MIYD

>PCR法とRT-PCR法では、元になるもの(DNAとmRNA)が違うので、

そうです。
PCRで使っている耐熱性DNA polymeraseはDNAが鋳型でないと伸張反応を行うことが出来ません。

そのため、DNAがテンプレートの場合はそのままPCRを行うことが出来ますが、
mRNAから増幅させる場合には、一度RTによってcDNAを合成させる必要があります。

お礼

回答ありがとうございます。
丁寧ですごく分かりやすく、疑問に思ってたことのすべてが理解できました。

返事のほうも早くにしていただけて本当に助かりました。ありがとうございます。

回答No.2

Freeuser

PCRはDNAの増幅法です。鋳型となるDNAの増幅したい部分の両端にプライマーをつくり、増やすのです。最初の鋳型となるDNAはどこからとってくるのですか？細胞ですね。

RT-PCRのRTというのはreverse transriptionつまり逆転写の略です。通常の細胞内で行われている転写はDNA→RNAですが、逆転写ではRNAを鋳型に相補的なDNAを合成するのです。
通常のPCRは、RNAを鋳型にして行うことができません。RT-PCRではまずRNAを逆転写してDNAを合成した後、できたDNAを鋳型としてPCRを行います。もとのRNAはどこから取ってくるかといえばやはり、細胞です。

お礼

早い回答をありがとうございます。
とても分かりやすい説明だったので
謎だった部分を理解することができました。
本当にありがとうございます。。

回答No.1

gori8063

これは、あるターゲットのタンパク質があって、その遺伝子を釣ってこようという実験系と考えてよろしいですかね？

DNAを釣ってくるようでしたら、お考えのようにそのタンパク質の部分配列（Ｎ末端とＣ末端である必要は特にないです）から、Regenaratedのプライマーを設計します。（アミノ酸からＤＮＡへ戻すときには重複コドンがありますから、よく配列をミックスしたプライマーを作りますね）

一方、ＲＴの場合はアミノ酸配列の片側だけがわかればよろしいかと思います。何しろ、片側は決まっていますから。そう、ポリＡです。

お礼

回答ありがとうございます。
とても参考になりました！！

何度も色々な質問に答えてくださって本当にありがとうございます！