インサートDNAが長いTAクローニング

質問

農学部に所属している大学4年生です。
現在実験でTAクローニングを行っているのですが、うまくいっていなくて困っています。
原因は、おそらく使用しているT-vectorに対してインサートDNAがかなり長く、ライゲーションしにくいためであると思われます。
使用しているT-vectorは、TAKARAのT-vector pMD19(Simple)で約2.7kb、インサートDNAは約6.3kbです。
ベクターとインサートの比はかなりのパターンを試していますが、T-vectorの残量が少ないために、いつも0.5～3µl程度しか使っていません。
ライゲーション時間や温度は、はじめは4℃でオーバーナイトなどで行っていましたが、ライゲーションキット（TAKARA DNA Ligation Kit ver 2.1）の説明書に「TAクローニングの場合は1時間以内で行うこと」とあったため、現在は16℃30分で行っています。

そこで質問させていただきたいのは
(1)普通、ベクター：インサート＝１：３～５の濃度で行うと聞いたのですが、ベクターよりもインサートの方が長い場合はベクターの濃度を濃くした方が良いのでしょうか？
(2)ライゲーション時間や温度はもっといい条件があるでしょうか？

ご意見をいただければありがたいです。よろしくおねがいします。

回答No.2

otx

あと、インサートDNAをPCRで増やしたプライマーを使って
コロニーPCRをやっていると思いますが、

そもそものインサートDNAを増やした時のテンプレイトが何か知りませんので何ですけども、

Tベクターに入っているのであれば、インサート+ベクターで
約10kbpになり、しかも大腸菌からのコロニーPCRになるので
コロニーPCRがインサートは入っているのも関わらずうまくいっていない可能性も。
（まぁ、ポジコンとかおいていると思いますが）

なので、やっていないのなら、数クローンからプラスミドを取ってみて
制限酵素でチェックしてみてもいいのではないでしょうか。

お礼

テンプレートDNAは麹菌RIB40の抽出したゲノムを使用しています。

初めはインサートを増やしたプライマーでコロニーPCRを行っていたのですが、それですと確かめるだけで5時間かかってしまうため、現在はインサートの一部（約2kb）を増やすプライマーで確かめています。ですが、コロニーPCRでバンドが出ていたはずが、その菌のプラスミドを抽出して同じ部分をPCRにかけてもバンドが出ません・・・念のためマスタープレートから同じ菌でもう一度コロニーPCRをしてもバンドが出ません。間違いなく同じ菌を使っていますし、プラスミドが抜けないようにインキュベートも12時間以内で終わらせています。

たまにバンドが出たコロニーも出なかったコロニーもプラ抽していますが、バンドが出ていたのに明らかにプラスミドが小さかったり、大きさはちょうど良くても制限酵素処理やPCRの結果が良くなかったりです。
一度プライマーは作り直しているのですが・・・

回答No.1

otx

まぁ、わかっている所もあると思いますが、確認です。

インサートのDNAはPCRで増やしたものであると思いますが、
使ったDNAポリメラーゼ（Taqなど）によっては、平滑末端になるので
TAクローニングは出来ない場合があります。

あと、ライゲーションの反応時間ですが、
私はもっと長くすると思います。
特に原理がどうとかではありませんが、

４℃１６時間とか、１６℃３－４時間とか。

あと、TAクローニングがうまくいっていないとは、

大腸菌が全く生えてこないのでしょうか？
それとも
大腸菌は生えてくるがインサートが入っていないのでしょうか？

前者ならば、コンピテントセルの質を検討する必要もあると思います。
後者ならば、Tベクターが劣化している可能性があると思います。

あとは、TAクローニングは諦めて、プライマーに制限酵素の配列を加えて
それでベクターに入れるとかを検討する必要があるかもしれません。

ライゲーションはハマってしまうと何が原因かよくわからないことが多いです。
でも、うまくいくときは何の問題もないというめんどくさいところもあるので大変です。
頑張って下さい。

お礼

回答ありがとうございます！
使っている酵素ですが、Ex TaqなのでTAクローニングは出来るはずです。
大腸菌が生えてくるのにインサートが入ってない場合と、大腸菌が全く生えてこない場合の両方です。
生えてくる場合は、コロニーPCRで確認しバンドが一つも出ていないことが多いです。プラ抽して大きさを確認しましたが、おそらくTベクターのセルフライゲーションだと思われます。

まずはアドバイス頂いたライゲーション時間・温度で実験してみたいと思います。
ありがとうございました！