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３者ライゲーションでかなり苦戦しています。何か良い方法等ありましたら、ぜひアドバイスください。 ライゲーションキットはRapid DNA Laigation kit(ロシュ)を使用し、ベクター側をSacI/NotIで処理しています（AP処理済）。インサート一つ目はSacI/BlnIで、二つ目はBlnI/NotIサイトでのライゲーションです。すべてアガロースから切り出し、生成したものです。反応時間はまず、インサートのmixtureで16℃15min、ベクターを添加して24℃10minです。ベクター：インサートモル比を1：3：3で行ってみましたがコロニーが得られませんでした。 　ベクター、インサートの消化はEPにより確認済み。にもかかわらず、ベクターのセルフが多発。