ｃDNAライブラリー作成について ZAPベクター

質問

ZAPベクターを用いてライブラリーを作成していますが、in vitroパッケージング終了後の段階で、インサートを確認したりすることはできるのでしょうか・・・？もしくはその前の段階で、ベクターに連結（ライゲーション）した後などでは可能でしょうか？
先日電気泳動をしたり、吸光度を測定することによってベクターの長さから換算してインサートの確認ができるというような事を聞いたのですが、どの段階から行うのか、泳動だったらアガロースでいいのか、何％なのかや、吸光度はDNAとして測定すればいいのかなど、いまいちよく理解ができませんでした。清書を見てもあまりそのような記載がないように思えるのですが、どなたかご存じの方がいらしたら教えて頂きたく質問しました。
どうぞよろしくお願いいたします。

回答No.3

ebikichi · ベストアンサー

>その後にwhiteの部分をさらにスクリーニングを続け

プラークのレプリカをとり、ハイブリでスクリーニングし、当たりをピックアップしたのに　確認PCRでネガティブ（インサートが入っていなかった）という事ですか？
クローニングなんてそんなものですよ　あきらめずに何度もチャレンジすることです。（もちろん各工程はポジコンなどできちんとチェックしてますよね？）

＞ベクターの長さがだいたい600ｂｐ位

そんなに小さいベクターがあるんですか？

回答No.2

ebikichi

追加です
作成したライブラリーを制限酵素で切って泳動ってことも考えられますが、ブロードになるでしょうね

回答No.1

ebikichi

私自身やったことがないので、、、、（隣で見てはいましたが）

ZAPベクターの場合　あまりインサートの確認はしないのではないでしょうか？
予想されるインサートの長さはどれくらいですか？
ファージミドの長さはどれくらいですか？
泳動で差は出るにしても　インサートの長さまで示唆できるでしょうか？（吸光度も同じです）

一番大事なのはRNAの質　second strand cDNAの質です
インサートの平均長が知りたい場合はsecond strand cDNAを定量すべきです（この場合量が少ないのでアイソトープを使うと思います）
ライゲーション効率を知りたい場合はb-galでＢ／Ｗができるはずです

いささかの自信もありませんが、お答えがないようでしたので回答したしました　失礼いたしました

お礼

早速のご返答ありがとうございます。
ZAPベクターインサート確認についてですが、パッケージング後に、ebikichiさんのおっしゃられているライゲーション効率を知るのと同様にBlue-Whiteでインサートのある程度の確認はできると思います。また、その後にwhiteの部分をさらにスクリーニングを続け、最終的にはin vivo Excisionによってファージミドを作成し、その際にPCRを用いたインサートの確認を行うのですが、前回この通りにWhiteだったのを行っていったのですが、最後のインサート確認PCRで全く入っていないという結果になってしまっていました。このため、その前段階での確認も必要なのではと思い、今回の質問になった経緯です。
また、インサートサイズについては、だいたい500から600ｂｐ位のものを予想していますが、実は目的のｃDNA自体の大きさがはっきりしていないのではっきりはわかりません（わかりにくい表現ですみません。つまりまだ未知のものをターゲットとしてライブラリーを作成しようとしているので…。）
多分ベクターの長さがだいたい600ｂｐ位であるということから、インサートが入っていれば泳動に差ができるのでは、という意見なのだと思うのですが…。
ややこしくなってしまって申し訳ありません。