ライゲーション→トランスフォーメーション

質問

ライゲーション→トランスフォーメーションが上手くいきません．
トランスフォーメーション後のプレートにはコロニーは沢山生えてきます．ネガティブコントロールとしてベクターのみでライゲーション→トランスフォーメーションするとプレートには殆どコロニーは生えてきません．
しかし，コロニーを拾ってMiniPrepし，適当な制限酵素で切断したりしてアガロース電気泳動すると予想だにしないバンドが出てきます．２０個くらいに対し１個は予想されるところにバンドはくるのですがセルフです．

ベクター（10 kbp）の方はBamH Iで制限酵素切断して，BAP処理をしています．インサート（2 kbp）はBgl II及びBamH Iで切断しています．Bgl IIとBamH Iの切断部位の相同性を利用したライゲーションです．濃度はベクターが0.03 pmolでインサートは0.3 pmolです．
ライゲーション時間は１，３，１７時間試しましたが，全てダメでした．

大腸菌はJM109です．

ライゲーションが上手くいっていないのか，それとも大腸菌の中で異常が起きているのでしょうか？

回答No.2

blackdragon · ベストアンサー

#1です。

>インサートは，元々プラスミドの中にBgl II-insert-BamH Iで入っていたものを切り出して，ゲル抽出により精製しました．精製後のinsertはアガロース電気泳動で確認しました．

>泳動バッファーは新しいものを使いました．染色液は使わず，エチブロをはじめに入れたゲルを使いました．

了解です。

だとすると、変な断片がやってくる余地はあまりなさそうですね。
切り出しを低波長の紫外線下で長時間かけて行ってしまって、変な断片になってしまったということもあり得なくはないでしょうが。

残る疑問点は、
＞２０個くらいに対し１個は予想されるところにバンドはくるのですがセルフです．

というところですが、10kbと12kbなら、はっきり区別がつくはずですよね？　だとすると、予想されるところにきたバンドがセルフというのはどういうことでしょう？

あと、予想だにしないサイズというのは、具体的には？

ベクターまたはインサートに、繰り返し配列等がないとすると、再編成がおこる可能性はあまりありませんね。
インサートは、大腸菌内で有害な作用をする可能性があるものでしょうか。だとすると、変なことが起こる可能性は大きくなりますが。

あと考えられるとすると、切り出しのときに、間違ってインサートじゃなくてベクターのバンドを切り出してしまってたりはしませんよね。

あとは、TEなどに、プラスミドが混入している可能性もありますが、同じものをネガコンにも同様に使っていたなら、その可能性はほぼ無視できますね。

とりあえず、最初からやり直してみることをお勧めします。

それでもうまくいかない場合は、低コピー数のベクターを使うとか、pUC系のベクターなら、培養温度を下げてコピー数を少なくしてみるといったことも有効かもしれません。

お礼

大腸菌に対して有害な作用をする可能性のあるインサートとは？？

blackdragonさんの言うように初めからやり直してみます．ありがとうございました．

回答No.4

Penfield

もし、インサート用内部を認識するプライマーとベクターを認識するプライマーの両方をお持ちなら、ライゲーション後、に確認のためのPCRをしてみてはどうですか？
あと、チェックの際も制限酵素の前にもしできるのならコロニーPCR（参考URLの２ページ目に方法の記載あり。）をすることをお薦めします。

　もともとのプラスミドがコンタミしている可能性もあるので、切り出したインサートを制限酵素などでチェックすることもお薦めします。

　ライゲーションの時間ですが、室温で２，３０分で十分のような気がします。
特に長いからいいというものでもないと思います。
長すぎると、逆に問題が出てくる場合もあります。

参考URL：

http://www.invitrogen.co.jp/tech/hyakubun/bh030926.pdf

回答No.3

jellicle-cats

ネガティブコントロールとして、ベクターのみだけでなく、インサートのみというのもやっていますか？
もしインサートのみでコロニーが出てきてしまうようでしたら、インサート側にコンタミ（切り出しのときにインサート側のベクターが混ざっていた）がある可能性があります。
インサートが入っていたベクターの大きさがどのくらいなのか判りませんが、どうしてもコンタミしてしまうことはあります。インサートの切り出しのときに、ベクター側のみをカットするような制限酵素でカットしてから、BamHI/BglIIでカットするようにすれば、インサート側のベクターのコンタミは防げると思います。

お礼

質問してからの実験より，インサートの方が怪しそうな結果が出ましたので，確認のために試してみます．

回答No.1

blackdragon

インサートは、どうやって調製したものですか？

電気泳動・切り出しはしましたか？

電気泳動したとすると、泳動バッファー、染色液は新しいものを使いましたか？

ライゲーション前後のDNA溶液を一部とって電気泳動してみましたか？

補足

インサートは，元々プラスミドの中にBgl II-insert-BamH Iで入っていたものを切り出して，ゲル抽出により精製しました．精製後のinsertはアガロース電気泳動で確認しました．

泳動バッファーは新しいものを使いました．染色液は使わず，エチブロをはじめに入れたゲルを使いました．

ライゲーション前後のサンプルは電気泳動して確認していません．確かに確認すべきところだと思います．