ライゲーションが上手くいきません

質問

ベクターの構築をしてるのですが、
インサートが５ｋｂでなかなか上手く入ってくれません。
bluntと、５’突出末端でライゲーションしトラフォメ後、コロニーはでるのですが数も３０こくらいで、多くはありません。
N,C（ベクターのみ）はコロニーがでていないのでセルフライゲーションは多くないのですが、目的のインサートを含んだコロニーがないんです。どうしたら良いでしょうか？

回答No.1

desert · ベストアンサー

方法(1)
ライゲーション反応溶液中のベクターの濃度を少し上げて、インサート濃度を少し下げる。
方法(2)
インサートを3kbp、2kbpに切って、一方をベクターへ入れて形質転換、培養、ミニプレ、制限酵素処理、残りのインサートを入れて…。

というような方法しか思い当たりません。
(1)の方法で目的物を得られる確率がわずかに上がります。
(2)の方法はベクターとインサートの制限酵素部位によっては使えません。
私も同様な状態で非常に苦しんだことがありますが、(1)の方法で確率を上げて、あとは回数でカバーして目的物を得ました。私の場合は酵母シャトルベクターに4.5kbp位のインサートを入れて大腸菌の形質転換でしたが、そもそもライゲーションがうまく行きにくい上に、うまく行ったベクターはサイズが大きすぎて大腸菌に取り込まれにくいということで、やる前から苦労は必至でした。
そうそう、それと、使用されているベクター、インサートは十分きれいなものでしょうか？どこかのキットを使ってきれいにしたものを使ったほうがいいかもしれませんね。
以上、参考になるといいのですが。

お礼

DNAをもう一度精製しなおしたものを用いたらしっかり入ってくれました。アドバイスありがとうございました。

回答No.2

geneticist12

ベクターとインサートの調製方法、特に末端のリン酸化の状態と精製方法について情報ください。それと、ふだんは、ほかのライゲーション、トランスフォーメーションはうまくいっているのですか（例えば、もっと短いインサートとか、両端付着末端のような場合）。