平滑末端のライゲーション

質問

平滑末端同士のライゲーションは効率が悪いのであまりやらないものなのでしょうか？
上手な人や運がよいときはどのくらいの確率で成功するものなのですか？
経験者の方教えてください。

ゲル切り出し後、SAP（promega製）を使って脱リン酸化をしてライゲーションをしたのですが、セルフライゲーション産物ばかり出てきます。
SAPの反応は説明書通り、37℃、15min、65℃、30minとやりました。

ベクターは10kbp、インサートは1kbpです。

回答No.5

Chicago243 · ベストアンサー

>時間を長くするのはいいかもしれないですね。
それはいいかもしれません。あとDNAの量を減らすと酵素とDNAの比率が代わりますからましになるかも知れません。

>失活させないとコロニーがでないので失活はできていると思います。
失活しているか、最初から失活していたか、、、
SAP処理が完全で、65℃、30minで失活した場合セルフライゲーション産物はいっぱいはでないです。何か矛盾を感じませんか?

あ、わたしが50-90%ぐらいの割合と書いたのはコロニーに中にの50-90%ぐらいの割合でインサートが含まれるということです。一回のトランスフォーメーションの成功率は95%ぐらいです。

>活性って調べられるんですか？
SAP処理前の処理後のプラスミドをライゲーション(インサートなしで)してトランスフォーメーションして得られるコロニーの数を調べればわかります。全然差がないようであれば文句をいっても良いでしょう。違うロットのものを送ってくれるかもしれません。でも違うロットでも商品は同じなので同じことが起こる可能せいがあるので、周りの人がその商品を使っていてうまくいっているという話がないようでしたら違うものを買った方が無難かもしれません。私はTAKARAのBAPを使ってました。

>当たりが少し得られたということは活性には問題なんでしょうか？
少なくとも活性が幾らかはあったような感じです。そういう話なら反応時間を伸ばすとよりよくなるかもしれませんね。

>脱リン酸化しなくてもインサートをたくさん入れたら
>成功するのですか？
これこそ、運が非常に強くないと成功しないでしょう。

補足

コロニーの中に95%ってすごいですねえ。
なんで平滑末端のライゲーションがそこまでうまくできるんですか？

活性といえば吸光度とかをはかってするもんだと思っていました。

コロニーはできなくてもいいので当たりがたくさん欲しいです。
コロニーにインサートが入っているかどうかはどうやって調べていますか？
調べるの大変じゃないですか？
私は64個のコロニーから3つをみつけましたが。
この確率は現実的ではないですよね？

SAPはプロメガというメーカーのやつを使っています。

＞＞>失活させないとコロニーがでないので失活はできていると思います。
失活しているか、最初から失活していたか、、、
SAP処理が完全で、65℃、30minで失活した場合セルフライゲーション産物はいっぱいはでないです。何か矛盾を感じませんか?

感じますねえ。
とりあえずＳＡＰの反応時間を長くしてみます。

コロニーはプレートに何個くらいできるんですか？

回答No.10

Chicago243

>PCRを行うと複数バンドが現れるので切り出した方が
>いいんでしょうか？

そういった場合は切り出して対応することがあります。特異的なバンドであれば読めるはずです。

回答No.9

Chicago243

>コロニーシークエンスはきちんと読めるんですか？
>あくまでも緊急の策ですか？
コロニーからのPCRプロダクトのシーケンスです。
PCRがうまくいっていれば読めます。人のゲノム配列を読む時も必要な部分をPCRで増幅してそこをシーケンスします。そんなに変な方法ではないと思います。ただそういうこともできるということなので目的によって使い分けるのがいいかと思います。

>やはりミニプレップしてからの方が綺麗に読めますよ
>ね？
この点についてはたしかにそうでしょう。

お礼

PCRを行うと複数バンドが現れるので切り出した方がいいんでしょうか？

回答No.8

Chicago243

>コロニーPCRってシークエンスをすることも可能なの
>ですか？

PCRした産物を必要料取ってシーケンス反応をすれば基本的にできます。

>メジャーな方法なんですか？
>コロニーPCR自身はわたしは特別な事情がない限りやりませんが、結構採用している人は多いと思います。

コロニーPCRをして、シーケンスする人は多くないと思いますが、目的によっては考慮しても良いのではと思います。

補足

コロニーシークエンスはきちんと読めるんですか？
あくまでも緊急の策ですか？
やはりミニプレップしてからの方が綺麗に読めますよね？

回答No.7

Chicago243

>コロニーを直接電気泳動できればいいんですが。そん
>な方法はないですよね。

ないと思うのですが、なんかそれらしい話を聞いたことがあります。直間的にはあり得ない方法かなと思いますので、なんかの間違えかも知れません。

>コロニーPCRってそこからシークエンスを行うんです
>か？

コロニーをチップなどで触りそのチップをPCR反応溶液に浸します。チップを取去ってそれをPCRします。インサートが入っていれば特定のサイズにバンドが現れるプライマーをつかうと、どのコロニーがインサートを持っているか分かるわけです。もちろん目的によってはシーケンスしてもかまわないと思います。

補足

コロニーを直接電気泳動する方法を誰か見つけて欲しいものですねえ。

コロニーPCRってシークエンスをすることも可能なのですか？
基本は増やして電気泳動ということですか？
メジャーな方法なんですか？

回答No.6

Chicago243

>コロニーにインサートが入っているかどうかはどうや
>って調べていますか？
>調べるの大変じゃないですか？
>私は64個のコロニーから3つをみつけましたが。
>この確率は現実的ではないですよね？

やはり個人差、難しさなどでいろいろ確率が変わります。私は平滑だと10-20個ぐらい拾ってダメなら違うベクターに移して、違うクローニングサイトで拾うとか、ベクターの切る位置(酵素)を変えてみるとか、使ったことはないですがアダプターを使うというのも選択肢の視野に入ると思います。20個拾って逆しか取れなかった場合、もう少し踏ん張ってさらに20個ぐらいは取ると思います。オートマティックなプラスミド精製機を使っていれば64個はそんなに非現実的ではないと思います。

私はコロニーの数はそんなに拾わないので素直にミニプレップして、制限酵素処理で断片の長さを確認してます。コロニーPCRをする人がいますが、コロニーPCRをして、そのあとミニプレップをしてというのはこのスケールでは馬鹿馬鹿しいです。

ただし、根性で拾う人はいます。96wellでコロニーPCRをして、インサートのあるクローンを選ぶという人もいます。または、プレートにニトロセルロースやナイロンメンブレンをかぶせ、レプリカをとり、ハイブリしてシグナルを検出する人もいました。1000個のスクリーニングで2、3個拾えたというプラスミドをもらったことがあります。

>コロニーはプレートに何個くらいできるんですか？

1-100個ぐらいです多くてたまに500個
最初に少し触れたと思いますが、私は非常に簡単と思えない時、まずアルホス処理後のベクターのみでライゲーションし、バックグランドを見積、バックグランドが10以下のプラスミド量でインサートとライゲーションします。ですから総体的に高い確率でインサートが拾えるわけです。標準的なプロトコールはプラスミド10-50ngを使うと書いてあると思いますが私の場合はたいてい1ng前後になっているように思います。そういう意味で数は少な目です。ベクター:インサート=1:100あたりになるとこのライゲゲーションで10個以下の場合があります。同時にやった1:1や1:10の場合は100前後であれば、感触として入ったと思えます。1:1や1:10で100個というのもバックグランドの見積から考えて非常に多いですから、バックグランドがインサートを含むライゲーションでも同様の数バックグランドが出るとすると90%ぐらいは入っているということになります。実際そこまで行かないにしても、結構好頻度でインサートの入ったやつが得られます。逆にうまく行かない時はバックグランドと同じぐらいの数で合わせて10-20個くらいでしょうか。この場合でも一応インサートの確認はします。数的にはそんなにしんどいと思えないので。でもこういう場合でも結構入っていたりします。

お礼

ミニプレップとはプラスミド精製のことですよね？
もしかしてキアゲンのキットをおつかいですか？

また、制限酵素反応では方向も確認できますよね。

補足

コロニーを直接電気泳動できればいいんですが。そんな方法はないですよね。
コロニーPCRってそこからシークエンスを行うんですか？

実験上手だといわれませんか？
また、ライゲーションより難しい実験ってあるんですか？
RNAは難しいみたいですが。

回答No.4

Chicago243

>コロニーがたくさん出ているのでSAPの失活はきちん
>とできていると
>いうことですよね。

コロニーがたくさん出ているのでSAPの酵素処理が不完全なのでは?

>腕というのはセンスみたいなもんなんですかね？
センスといってしまえばそうですが、どのステップが重要で、問題がある時どの過程が悪いのかが見抜けるかです。方向は運です。でもインサートのはいっているプラスミドの確率を増やせば運に依存されにくくなります。

＞プラスミドにもニックは入るのですか？
原因は大腸菌からのDNaseの持ち込み、試薬のDNaseのコンタミ、プレパレーションの時の大腸菌のオーバーグロース、プラスミドが大腸菌に影響をあたえて、大腸菌の調子が悪い時、過剰な制限酵素処理、、、
スーパーコイルのプラスミドが取れているかチェックするべきです。

>1というのはベクターですよね。
そうです。インサートの量をふるということです。

補足

SAPってすごく効きがよいらしく、
37℃、15minすればよいと説明書に書いてありました。
時間を長くするのはいいかもしれないですね。
失活させないとコロニーがでないので失活はできていると思います。

また、SAPの活性を疑うのもよいかもしれないですね。
活性って調べられるんですか？
使って効果がなかったらオーダーするという形になるんでしょうか？

当たりが少し得られたということは活性には問題なんでしょうか？

脱リン酸化しなくてもインサートをたくさん入れたら
成功するのですか？

回答No.3

Chicago243

平滑末端でも運10%、腕90%です。インサートによりますが50-90%ぐらいの割合で取れます。

各酵素が働いているかは確信がなければポジコンを取るべきです。ライゲース、フォスファターゼなどはしっかりと効いているかチェックするべきです。まずベクターの切れ残りを排除するため制限酵素処理後は電気えいどうしゲルから切り出すのが無難です。フォスファターゼ処理したものとしていないものでライゲース処理し劇的な差があることが前提です。
私の場合はベクターだけでライゲース処理したトランスフォーメーション
をまず行い100クローン出ればその1/20-30のDNA量でインサートとmixしてライゲーションします。つまりバックグランドを10いかに抑えてポジティブを拾う確率をあげるわけです。フォスファターゼがいかに効いていても酵素反応ですから0.01%ぐらいは燐酸を持っているかもしれないと思いますし残っている量も毎回一定かどうか分からないのではと思っているのでわざとこのような操作をするわけです。
インサートの量はモル比で1:1、1:10、1:30-100ぐらいまでふります。きっと驚かれると思いますが、1:30-100になると場合によってトランスフォーメーション効率がガクッと落ちてきます、その時得られたクローンは90%以上入っていることが多いです。たかい比率で得られたクローンを優先的に見ていけばあたりの確立が高いということです。ただ小さなインサートの時はダブルで入ったりという可能せいも稀ですがあるので拾ったクローンは注意深く調べる必要があります。
あとコンピテントの効率は10^7ぐらいないと難しいクローンは取れないです。DNAもニックが入ってないかとかチェックする必要がありますよ。
もし、ベクターを制限酵素で切って、インサートを入れたあとその制限酵素サイトがつぶれ、しかもインサートにその認識部位がないとき、ライゲーションのとき、またはその後その酵素で処理してセルフライゲーションをおさえるてがあります。この時はフォスファターゼ処理はしなくていいでしょう
インサートはPCRプロダクトですか?それなら末端を燐酸化しないといけないかもしれませんね。PCRプロダクトは大腸菌から排除されやすい傾向にあるので少し工夫が必要です。
システムが確信できてそれでも取れないことがたまにあります。そういう時は深入りせず、方法論をかえます。また予め2種類の方法論を並行してやっておくといいかもしれないです。
DNA切出しのときUVを使っているようであればなるだけ長波長を使い時間をかけないようにするか、UVを使わない染め型に切り替えるとベターであると最近よくいわれてます。インビトロジェンがその手のキットを出してますが、色素さえあればきっと出なくてもできます。

補足

腕というのは何なんですか？
ライゲーションってただ比率を見積もって
混ぜるだけですよね。不可視の領域ですし。
ピペッティングで混ぜ、スピンダウンで落としたりはちゃんとやっています。腕というのはセンスみたいなもんなんですかね？

しかし、方向は運ですよね？

インサートはPCR産物ではないです。
ベクターを移す作業をしているのです。
インサートを制限酵素で切り出、
ベクターを制限酵素で切り
ライゲーションでくっつける作業です。

＞DNAもニックが入ってないかとかチェックする必要がありますよ。
プラスミドにもニックは入るのですか？

＞インサートの量はモル比で1:1、1:10、1:30-100ぐらいまでふります。
これはインサートを増やしていくということですよね。
1というのはベクターですよね。
コロニーはあまり出なくてもいいので当たりが欲しいです。
次はセルフライゲーションは嫌なので
インサートをたくさん入れてやってみます。

コロニーがたくさん出ているのでSAPの失活はきちんとできていると
いうことですよね。

ちなみにUVは使っていません。
BIODYNAMICSのゲルきりだしキットを使っています。

回答No.2

notime

平滑末端同士のLigation の効率は実験的に調べたわけではありませんが、明らかに悪かったので、なるべくなら避けていました。

ゲル切り出し後にSAP 処理をするのですか？制限酵素処理に続いてSAP 処理をしてから、泳動・ゲル切り出しを行った方が良いかもしれません。
（37℃ 15min というのは制限酵素処理ですか？それでしたらSAP 処理の時間をもう少し長くする方が良いかと思います。）

私の場合ですが、それでも平滑末端のSAP 処理の効果はよくありませんでした。もしかしたらSAP の条件検討よりvector とinsert の量を検討された方が良いのかもしれません。

またTA cloning という手法もありますから、そちらも検討されるとよいかと思います。

お礼

TA cloning とはTOPOを使うもののことですか？

補足

セルフライゲーションばかりで効率悪すぎですよ。
SAPを失活させないとコロニーがでませんよね？
コロニーはたくさん出ています。

TA cloningとは何ですか？
VECTORとインサートの量はインサートが多い方がセルフライゲーションの確率が下がるのでいいんでしょうか？

はい、ゲル切り出し後にSAP処理をします。
SAP処理が37℃、15minです。
これを長くしようかなと思っています。

回答No.1

subaru361

経験者です。が、私は下手でした・・・・(＾＾;
そのときの助手の話としては、リン酸化なんかしないでやった方がいい。インサートを多めに入れてみろというのがアドバイスでした。

確率はまぁ覚えてませんけど、最終的にはできました。1kbなら、うまくやれる人ならまず入ります。

お礼

インサートが一つ以上入ることはないんですか？
ダブル、トリプルにインサートが入ると困りますよね？

補足

インサートが一つ以上入ることはないんですか？
ダブル、トリプルにインサートが入ると困りますよね？