サイズのおかしいインサート

質問

pET22ベクター（約5500bp）をXhoIとSalIで処理し、同じく処理したインサート（1200bp)をライゲーションし形質転換しました。30個のコロニーについて断片確認を行ったところ、すべてのコロニーについて同じ電気泳動パターンが見られました。それは、約6000bpにバンドが一本、それと約3500bpに一本です。3500bpのバンドは6000bpのものよりだいぶ明るいのです。もしかしてインサートが３つつながったものかと思い、これらのプラスミドについて、1200bpのインサートを増やした時のプライマーを用いてPCRしたところ、コントロールとしてPETベクターを鋳型にした時と差がみられませんでした。どうしてこのような電気泳動パターンがでたのか、理解できません。どなたか、教えてください。

回答No.1

geneticist12 · ベストアンサー

結論を言うと、それはno insertのpETで、3500bpのバンドはccc、6000bpのバンドはOCでしょう。

考えに入れていなかったのかもしれませんが、XhoIとSal Iは付着末端が同じですから（compatible endというやつです）self-ligationは容易に起こります（したがって、このデザインではdirectional cloningはできません）。

もちろん、プラスミドは切ってから泳動しているのでしょうね。でも、この場合、self-ligationしたプラスミドはXhoI、Sal Iでは切れませんから。何かほかの適当なone cutの酵素で切ってごらんなさい。pETのサイズが出るはずです。

お礼

目から鱗が落ちた感じです。XhoIとSalI同士がくっついてしまうとは全く考慮していませんでした。もちろんプラスミドは切ってから泳動しましたが、これで説明がつきますね。
本当にどうもありがとうございました。これですっきりしました。