プラスミドDNAの精製

質問

シークエンス反応に使うプラスミドDNAを抽出したのですが、反応が十分に行かないのか、塩基配列をあまり読むことができません。サンプルのプラスミドDNAの純度に問題があるような気がするのですが、純度がよいDNAを抽出する方法を(経験)コツなどを含めてご教授願えますでしょうか。
プラスミドDNAは大腸菌から抽出します。シークエンス反応はサイクルシークエンス法です。泳動はアクリルアミドゲルで行っております。

回答No.9

alice_with_tak · ベストアンサー

No.7です。遅れて申し訳ありません。
まずCIAはクロロホルム：イソアミルアルコールです。DNAの場合は24：1で混合ですね。

プラスミド抽出に関して、簡単な工程は以下の通りです。
(1)菌体をSol.1に再懸濁させ、RNaseを加える。
(2)Sol.2を加える。
(3)溶液が透明になったら（たぶん10秒くらい）ただちにSol.3を加える。
(4)15分程度放置。
(5)PCIを溶液と等量入れ、ボルテックス、遠心。
(6)上清を回収し、CIAを等量入れ、ボルテックス、遠心。
(7)上清を回収し、2-プロパノールを等量入れ、ボルテックス、15分間放置後遠心。
(8)上清を捨て、ペレットに70％EtOHを加え、遠心。
(9)上清を捨て、ペレットを風乾、TEや超純水に溶かす。
です。なお以上の方法はすべて常温で行ってください。溶液も冷やしたりしないでください。

補足

(4)(5)の間に、遠心・上清を回収という工程をいれてもよろしいでしょうか？

回答No.11

alice_with_tak

私の場合はLB+Amp（終濃度100μg/ml）=3mlを処理しています。系は以下の通りです。

(1)菌体をSol.1（100μl）に再懸濁させ、RNase（10μg）を加える。
(2)Sol.2（200μl）を加える。
(3)溶液が透明になったら（たぶん10秒くらい）ただちにSol.3（150μl）を加える。
(4)15分程度放置。
(5)PCIを溶液と等量（500μl）入れ、ボルテックス、遠心（15000rpm、15min、RT）。
(6)上清を回収し、CIAを等量入れ、ボルテックス、遠心（15000rpm、5min、RT）。
(7)上清を回収し、2-プロパノールを等量入れ、ボルテックス、15分間放置後遠心（15000rpm、15min、RT）。
(8)上清を捨て、ペレットに70％EtOH（1ml）を加え、遠心（15000rpm、5min、RT）。
(9)上清を捨て、ペレットを風乾、TEや超純水（任意の量）に溶かす。
です。RNAが十分に除去されていないとのことでしたが、どのくらいの長さのものが除去できていないのでしょうか？もし50bp以下であれば塩に酢酸アンモニウムなどを用いて再度エタ沈を行うといいみたいです。100bp以上であればRNaseに問題があるはずです。また2-プロパノールの量が多くなっていたり、遠心の温度が低くなっていたり、フェノールのpHが変化していたりしないかチェックして見てください。

お礼

RNaseの濃度が低すぎたのと、処理の時間が不十分だったみたいです。ありがとうございます。

回答No.10

alice_with_tak

No.9です。

経験的意見としては入れないほうがいいと思います。チューブの壁にタンパクのつぶつぶがくっついてしまってうまく上清を回収できないからです。PCIを加えてボルテックスして遠心するときれいに3層に分かれますね。

お礼

なるほど、わかりました。ありがとうございました＾＾。

補足

きれいに３層にわかれました。教えていただいたとおりの操作(No.8)を、ひと通りDNA抽出操作を最後まで行い、電気泳動で確認してみましたところ、RNAが十分に除去できていませんでした。度々すみませんが、系も併せて教えていただけませんでしょうか？培養は私の場合、TB+アンピシリン1.5mlにて一晩です。

回答No.8

mizu_atsu

＞私が読もうとしている配列はGC含量が高いです。

そうであればウレア（尿素）含量の高い変性ゲルの使用をお勧めします。
また、それとは別にゲルはそのままで泳動温度を上げたものも試す価値があると思います。
ただし、どちらも機械が対応していればの話です。

ちなみに私はGC含量70％位のものを読んでいました。
部分的には100％GCのみのものです。
GC100%のところは100ベース位だったと思いますがそこを正確に読むのに（2種のシークエンサーで試行錯誤して）3ヶ月位かかりました。全体では4ヶ月ちょっとでしたのでほとんどの時間をそこに・・・
両側から何度も読んで頑張ってください。

お礼

はい、がんばります＾＾；。ありがとうございました。

回答No.7

alice_with_tak

No.4です。
経験的なことで申し訳ないのですが、最新のキャピラリーを使ったタイプではRNAの混入はそれほど結果に影響を与えないのですが、アクリルアミドゲルの場合はRNAの混入がかなり影響しました。おそらくゲルだけでなくサイクルシークエンスに用いる試薬なども関係しているのいるのだと思います。
RNase処理に関してなのですが、私の研究室ではPCI→CIA→エタ沈という工程で精製しています。ちなみに抽出後にRNase処理を行わず、抽出とRNase処理を同時に行っています。市販されているほとんどのキットはこのタイプになっているのですが、菌体を再懸濁させる溶液にRNaseを加えておきます。そしてアルカリ→中和を常温、短時間で行い、その後30分くらい常温に置いた後、PCI→...と処理してプラスミドを得ています。

補足

抽出とRNase処理を同時に行うということですが、詳しく教えていただけないでしょうか。
PCIはフェノール・クロロホルム・イソアミルの略ですよね。CIAは何の略なのでしょうか。

回答No.6

geneticist12

どうも、必ずしもプラスミドの精製度が問題とは限らないような気がします。しかし、それを疑うなら、キアゲンのような、定評のあるシステムで精製してみて、改善が見られるかどうかためしてみるのがいいでしょう。プラスミド精製専用のでなくてもいいです。普段の方法で精製したものを、QIAquick mini columnにでもかけたらいいでしょう。QIAquick mini columnは安価ですし、バッファーをかえるだけで、PCR産物の精製や、ゲルからの精製などにも使えますので、無駄な出費にはならないでしょう。

いくつか、補足を、
PEG/NaCl沈殿は、RNaseでオリゴ化したRNAが、プライマーとしてはたらき偽のバンドが生じるなど、バックグラウンドが高くなるのを防ぐのが目的です。シークエンス反応をklenowを使って37Cでやるような場合は必須でしたが、耐熱性ポリメラーゼで高温反応させるのが普通になった今では、やらなくても大丈夫みたいです。
↓ご参考まで
http://oshiete1.goo.ne.jp/kotaeru.php3?q=1383427

シークエンス反応後のエタ沈は、フリーの蛍光ラベルヌクレオチドを除くのが目的で、ABIのシステムでは必須です。フリーの蛍光が短鎖側にかぶったり、ゲルに吸着して、バックがあがってしまうからです。

いずれにせよ、バックグラウンドが問題ではないようですから、これらが関係しているとは考えにくいです。
ひょっとして、テンプレート過剰で、一気にプライマーを使い切ってしまっているとか（これだと、短鎖側のシグナルはめちゃくちゃ強くなりますが、ある程度以上の長さになると、ぱったりと言うパターンです）

補足

アルカリ法でプラスミド抽出をした後のサンプルと、さらにPCRの際に余分なprimerやdNTPを除くようなスピンカラムで精製したサンプルを使って、シークエンス分析してみましたところ、条件は全く同じでやったのにもかかわらず、後者の方は全く読めませんでした。純度を上げようとしたのが裏目に出たのでしょうか
。少し混乱しております。

回答No.5

mizu_atsu

読む配列がどのようなものかはある程度わかっているのでしょうか？
例えばGC含量が非常に高い領域は読みにくいです。
失敗するときはいつも同じ領域付近ということはありませんか？
そのような場合はサイクルシークエンスの温度やゲルの温度、種類を変更すると有効です。

そうではない場合ですが
機種によっては600ベースくらいしか読めないものもあります。
そういう場合は鎖を重ねて何度も読んでつなげるしかないと思います。

お礼

ご回答ありがとうございました。確かに私が読もうとしている配列はGC含量が高いです。鎖を重ねて読むしかなさそうですね。変異体の配列を読もうとしているので、ほとんど同じ配列を読もうとしているのですが、その時どきでよめ具合が違います。

回答No.4

alice_with_tak

補足をいただければ明確な回答ができます。

１．アルカリ法とのことですがキットを用いてるのでしょうか？
２．キットを用いていない場合、RNase処理はされていますか？
用いているシークエンスの系から予想されるにRNAの混入が最も考えられる気がします。

３．シークエンスPCRの後にエタ沈をされていないとのことですが、特にするなとの指定などがあるのでしょうか？
エタ沈を行わないと未反応のddNTPやプライマーなどが邪魔をすることがあるようです。

なお今までの部分に関して
PEG沈は私も行った事があります。某参考書にはRNAが取り除かれるとあるのですが効果はほとんどありませんでした。エタ沈は常温で行う必要があります。低温で行うと塩もそうなんですが余計な核酸まで沈殿してしまいますので。

補足

ご回答ありがとうございます。補足させていただきます。
1.2.キットは使用しておりません。RNase処理は行っております。RNAの混入は実験結果にやはり、かなり影響を与えるのでしょうか。RNase処理後は、そのままPCRに使用してよろしいのでしょうか？or なにか後処理が必要でしょうか。
3.シークエンスのマニュアルの通りでは、エタ沈の工程はありませんでした。PCR後のエタ沈は、行ったことがないので、試して比較してみたいと思います。
また、エタ沈はどの工程でも常温で行います。

回答No.3

tomoki

No.1のつづきです。

プラスミド抽出はスタンダードのアルカリ法mini prepで大丈夫でしょう。かつて（７年前）は自分もそのようにやってました。（PEG沈については知識がありません。ごめんなさい）

1サンプルにつき4本立てるということですので、かなり古典的な方法でされているようですね。自分はABI377のシーケンサーを使ってBigDyeterminationKitでのサンプル調整をしているので1サンプル1チューブですし、25ulの系でのシーケンスＰＣＲの後はエタ沈してそれを2ulのdyeの溶解してゲルのレーンにapplyする必要があるのでシーケンスPCRのあとdirectにdyeを入れて流すというのがうまく想像できません。

エタ沈を常温でやるのはシーケンスPCRの後のステップのみです。低温でやると蛍光のバックが高くなるためです。
以上参考まで。

補足

プラスミド抽出はtomokiさんと同じく、スタンダードのアルカリ法mini prepです。この場合、エタ沈は低温
のがよろしいのでしょうか。
シークエンスサンプルは、PCR後にそのままDyeを入れて、ゲルにアプライしております。

回答No.2

geneticist12

補足をお願いします。

あまり読めないというのは、どういう状態ですか。
短い距離はちゃんと読めるけれど、長い距離はバンドが出てこないのでしょうか、全体的にシグナルが弱いのでしょうか、バックが高いのでしょうか、、、？
シークエンスは、RIですか、蛍光によるオートシークエンスですか？　どの会社のシステムですか？

補足

あまり読めないというのは、短い距離はバンドがはっきりしており読めるのですが、徐々にバンドが判別しにくくなり、読めなくなります(シグナルが弱くなって？)。同じようなサンプルでも、成功する時と失敗する時があり、その差がよく特定できておりません。よく読めても5-600bpぐらいです。
　シークエンスは蛍光によるオートシーケンスでシマズの機器を使っております。

回答No.1

tomoki

プラスミドの抽出はどうやってますか？Qiagenなどのキットでやればまったく問題ない純度のDNAがとれます。

シーケンスの時バックのノイズが多くて読めないのであればシーケンスPCRのテンプレートのプラスミドDNA量が多すぎる、などの問題かもしれません。
また、シーケンスPCRのあとエタ沈してると思いますが、このとき通常のように低温でエタ沈（遠心を４度でやる、静置をー２０度でやるなど）すると塩が析出して汚くなります。

周りにうまくいっている人はいませんか？確立された技術ですのできっとちょっとしたことでうまくいくと思います。がんばってください。

補足

プラスミド抽出はアルカリ法で行っております。
最後はエタ沈し、そのサンプルをシークエンスサンプルとして使っております。PEG沈を行うと、抽出の仕方が悪いのかもしれませんが、かえって伸びません。PEG沈のコツなどあれば教えていただけないでしょうか。
　シーケンスPCRのあとエタ沈はしておりません。そのままダイを入れて泳動しております。1サンプルについてAGCT4チューブありますので、かなり労力がいることになります。
　エタ沈で低温でやらない方が良いとのことですが、アルカリ法の最後のエタ沈の時にも低温より常温でやる方が良いということでしょうか？