DNAの電気泳動法による長さの測定

質問

先日大腸菌・酵母から抽出したDNAを電気泳動にかける実験を行ったのですが、どうも理論値とそれぞれ300bp・80bpほどずれた値が出てしまいました。

なぜこのような差が出てしまったのか、分かる方、教えてください。

ちなみに実験手順はDNAの抽出→PCRによる増幅→電気泳動です。

回答No.4

negigi · ベストアンサー

アガロースの濃度にもよりますが、その程度なら誤差範囲だと思いますよ。2100と1800、820と740を完全に判別できる系でやってたりしますか？

PCR産物の量や、PCRからのバッファの持ち込みなんかで、バンドの位置は平気で前後します。自分もジェノタイピングのPCRで、目的800強が1000bpを超えた位置に出たこともありましたし、下手な人の泳動像なんかだと、同じもののはずなのに、バンドの位置がデコボコしてたり。ポジコンがあるなら、そのバンドの位置と比較ができますね。

産物を別の目的に利用するなら、配列を読むなり、適当な制限酵素で切るなりして、産物が目的のものか確認したらよいと思います。

回答No.3

negigi

ああ、最後読んでませんでした。PCR増幅したんですね。

としても、産物長が分からないことには、何とも言えないです。

お礼

回答ありがとうございます！

産物長はそれぞれ2100bp820bpでした。

どちらも理論値より短い結果となりました。

PCRによる増幅の際にポリメラーゼの失活などにより理論値とずれることはあるのですか？

回答No.2

negigi

実際、何を流したんでしょうね。質問を読む感じだと、PCR産物というよりは、抽出産物をそのまま、って感じですが。その誤差でゲノム全長ってことはないでしょうから、プラスミドだとは思うんですけど、もしそうなら、環状のままなのか、リニアライズしたのかも書かれてないですし。

流した産物の長さとか（ターゲット500bpで300bpズレてたら気になりますが、2000bpが2300bpになったところで、別に気にすることでもないですし）、理論値をどうやって出したか（つまり、それが正確にバンドの位置を表しているか）もこっちは分からないんですから、アドバイスのしようがないわけで。

つまり、何（長さ、形状、精製の有無）をどうやって（時間とか電圧とかゲル濃度とか）流して、何（マーカーだけ？ポジコンは？）と比較してズレてたのか、補足してくださいな。

回答No.1

1fan9

どこの領域を増やしたとか正確に分からないとはっきりと何も言えません。
それと、抽出したDNAを流したわけではないのですね。

80bpなんて誤差の範囲のような気がするのですが…。
アプライする量を変えたり何回流したりしてもそうなるのでしょうか？

ゲル作製時にゲルメーカーのコームが汚れていると泳動が少しおかしく
なることはあります。

又は、マーカーDNAのサイズが実際と異なるとか、

今回使った酵母や大腸菌のDNAの増幅領域の長さが、データベースに
載っているものとはたまたま違ったとかも考えられます。

良く分かりませんけど、
普通に実験がうまくいっていると考えると、理論値がおかしいです。
他の人がやってもそうだったりとか、マーカーやゲルとかを変えても
結果が同じとかなら特にそう言えます。