アルカリminiprep法によるプラスミド抽出の純度

質問

アルカリminiprep法によるプラスミド抽出の純度

こんにちは。早速質問です。

大腸菌を培養し、シーケンスのためにMini prepでプラスミドの抽出を行いました。
（マニュアルです）

その後、ＴＥに溶解し、吸光度計を用いて、ＤＮＡの濃度と純度を測定したところ、A260/A280=1.1
とかなり純度が悪くなってしまいました。（kitと比較してです。kitでは2.0ぐらいになります）
その後、エタ沈をしてもなぜか純度は全く改善されず、A260/A280=1.1のままでした。

どのような操作に注意したらよいのでしょうか？
よろしくお願いします。

回答No.1

stringf35 · ベストアンサー

ミニプレップ産物の制限酵素処理にRNase処理を組み合わせたときに、
泳動先端にRNAの分解産物が見えますか？

一般的なミニプレップキットだと、大腸菌を回収して
resuspendするバッファーにRNaseが入っていると思うのですが、
マニュアル法だとRNaseを省略している人がいる気がします。

RNaseがなければ、当然最終産物にRNAがコンタミしますので、
純度は悪くなります。

最初のバッファーにちょろっとRNase入れるだけなので、
試してみたらいかがでしょうか。

補足

RNaseは入れてませんでした。
どのくらいの濃度で加えたらよいのでしょうか？

回答No.3

tnlu

補足を追加されていたのを見たので。
RNaseは通常RNaseAを使います。
終濃度100μg/mlになるように加えてください。
もとが粉末なら、10mg/mlになるように超純水に溶かして
冷凍保存しておいて、solutionIのときに1/100vol入れればＯＫです。

お礼

わざわざありがとうございます。
RNaseAはキットでのプラスミド抽出に使うので、使ってみます。

ご丁寧な回答をありがとうございます。

回答No.2

tnlu

stringf35さんがおっしゃるように、RNase処理は重要です。
RNase処理してないプラスミド溶液を泳動すると
プラスミドのバンドより下に、ボワーっと結構強くシグナルが見えます。

タンパク除去はしていますか？
エタ沈の前にフェノクロをやればもっと綺麗に取れると思います。
酵素反応をフェノールが阻害するので、フェノクロのあとに
クロロホルムイソアミルアルコールで抽出すればより安心です。

お礼

RNase処理がやはり大事みたいですね。

エタ沈をしっかりやれば除タンパクできると思ったのですが、確かにフェノクロのほうが確実ですね。ありがとうございます。