DNAの欠損？

質問

こんにちは。
PCR法で増幅させたtet「DNAをpUC18にライゲーションさせ、
大腸菌のトランスフォーメーションを行ないました。
(大腸菌はAIXプレートで培養しました。)
その後ブルーホワイトセレクションによって白コロニーと青コロニーを
区別し、アンピシリン(終濃度100μg/ml)を加えたL液体培地で培養しました。
そして、プラスミド単離を行いサンプルを調製した後に電気泳動を
行ないました。
理論値を計算したところ、白コロニー由来のプラスミド溶液は上手く
トランスフォーメーション出来ていれば、バンドが約4000bp、
青コロニー由来のプラスミド溶液は約3000bpのところにバンドが見られるはずということになりました。

トランスフォーメーションに失敗していたら、白コロニー由来の
プラスミド溶液のバンドは青コロニー由来のプラスミド溶液と同じ
約3000boの位置になるはずですよね？
なのに、結果では青コロニー由来のプラスミド溶液のバンド、
約3000bpよりも下にバンドが出ているんです…。

先生に聞いたところDNAの欠損かもしれないということでした。
そんなことってあるんでしょうか？
また、このようなことが起こる原因はなんなんでしょうか？
ご教授よろしくお願いします。

回答No.2

guragura77

プラスミドは立体構造によって移動度がかなり変わります。電気泳動前にプラスミドを制限酵素で切って直鎖にしていないのであれば、それも考慮すべきです。
そういった内容の質問は「プラスミド　電気泳動」などで過去の質問を検索すると山ほどヒットしてきますから、中には参考になるものがあるかもしれません。ご確認ください。

回答No.1

arcago

こんにちはlilith-no7さん。
私もプラスミドへのクローニングを行ったことがあります。白コロニーにはインサートがあるというのが実験の前提ですが、最初のうちはなぜかスカをつかまされることが多いです。出所不明の断片が挿入されていたり、欠失していたり・・・。上手になってくれば、成功率は上がりますよ。
＞そんなことってあるんでしょうか？
ということですが、欠損が起こらないと考えておられる理由は何でしょうか。反応系の中に含まれているDNA分子は非常に多数です。頻度はともかく、たまたま、欠損することがないとは言えません。誰かさんではないですが、「起こちゃったのだから仕方がない」と考えるしかないと思います。