プラスミドＤＮＡのい精製がうまくいきません・・・なぜ？

質問

形質転換をしてアンピシリン耐性の大腸菌から、プラスミドＤＮＡをアルカリーＳＤＳ法により分離した所、精製したプラスミドＤＮＡをアガロース電気泳動をしたら、バンドの蛍光がすごく薄く、少量のプラスミドＤＮＡしか分離できませんでした・・・溶液も確実に加えていったつもりだったんですが・・・プラスミドＤＮＡ分離がうまくいかない原因がよくわかりません・・・どういうミスでそうなってしまうのか原因として考えられる事があったら教えてください。お願いします。
今プラスミドＤＮＡを使う実験に興味がありいろいろしてるんですがうまくいかず・・自信喪失状態でして・・回答して頂いたら嬉しいです。お願いします。

回答No.4

alice_with_tak · ベストアンサー

No.3です。

電気泳動をやり直すとうまく出てきたということは、電気泳動条件が変わっていない限り（アプライした量や再度精製したプラスミドを用いたなど）、おそらく電気泳動時の操作に問題があったのだと思います。

もしくは精製時エタ沈を行っているとのことでしたが、しっかりとペレットを乾燥されたでしょうか？電気泳動のときアプライは正常に行えたのを確認できましたでしょうか？乾燥がうまくいっていない場合、溶液中にエタノールが残留することによってDNA溶液の比重が下がり、電気泳動用のLoading Bufferと混合したとしても水より軽くなってうきあがってしまうことがあります。その場合は規定以上のLoading Bufferと混合することにより問題を回避することができます。

以上考えられることを書いてみました。不十分でしたら補足要求をしてください。

お礼

ありがとうございました。
アプライのミスが原因かもしれません。知らない事をたくさん教えていただきありがとうございました。
すごく参考になりました。

回答No.3

alice_with_tak

補足をお願いします。

(1)キットor自作のキットなのか？キットであればメーカーを
(2)精製はどうやっているか？PCIorCIAを使用しているか？アルコール沈殿、PEG沈殿の条件等。
(3)キットを使用していない場合、RNase処理をどうしているか？
(4)電気泳動の条件（そのまま、もしくは制限酵素切断後）、バンドが確認できるのか？それともどんよりしているのか？

教えていただけると回答できると思います。

補足

自作ではなく先生がすべて用意してくれたものなんです。
精製はフェノクロ処理してエタ沈を行いました。
電気泳動は制限酵素で切っていないものです。バンドは確認できますが、薄くでています。バックグランドが明るすぎたのかもしれません。
もう一度しなおすと、きれいにバンドがでたんで、精製はうまくいっていると思われます。
電気泳動でウェルにアプライするので失敗したか、確実にピペットマンですえていなかったのでしょうか？
詳しく補足できなくてすみません

回答No.2

MIYD

No.1さんに追加すると、

本当はちゃんと取れているけれどもともとのスケールやゲルにアプライした量が少ない
→どの大腸菌株にどのプラスミドをいれてどれくらいのボリュームで培養して、最終的にどのくらいのTEなどに溶かしたのでしょうか
http://www.promega.co.jp/cat/technical/17-q.html

EtBrなどが弱っていて検出できていない
→マーカーDNAはちゃんと蛍光が検出できているのでしょうか

マーカーDNAはちゃんと検出できているけれども非常に蛍光量が強い
→マーカーDNAの濃度を間違えて作っていて、相対的にサンプルの濃度が薄いと計算していないでしょうか

フェノクロ、エタ沈をやっているのでしたら
そこで塩を入れ忘れている
→始めのイソプロ沈はSolIIIなどの塩で落ちますが、
2回目は塩を入れる必要があります。

あまりにも情報が少ないので、
原因が何かを予想することが出来ません。
ここに材料と全操作を書いたほうがいい回答が得られると思います。

回答No.1

panda_

思いつくことを挙げてみます。

○アンピシリン濃度が薄く、プラスミドが入っていない大腸菌が多かった
○Solution IIのアルカリ規定度が低い（調製後時間が経つとこうなる）
○均一に懸濁できていないため、アルカリでうまく溶解できていない
○エタ沈のエタノール量が少ない

○元々Low-copyのプラスミドだから量が少ない

お礼

情報がすくなかったのに、たくさん予想していただき、ありがとうございました。
参考に実験を行い、やり直しもしました。
参考になりました。