DNAの精製で注意する点

質問

PCR法によって増幅したDNAを制限酵素処理しライゲーションする実験をしているのですが、PCR産物が酵素で切断できていない可能性があり(電気泳動の時点では判断つかないので)、サイト検索で調べたりなどしてDNAの精度が問題となることが多いと書いてありました。PCR産物の精製はフェノール/クロロホルム抽出後エタ沈でしています。フェノール/クロロホルム抽出→クロロホルム抽出→エタ沈一晩→エタノールで2回洗い→乾燥です。大雑把な説明ですが、

1)フェノール/クロロホルム抽出
2)エタノール沈殿

について特に注意点などありましたら助言お願いします。なお、今使っているプロトコールは他の人で成功しているものなので、それ自体には間違いはありません。

回答No.3

geneticist12 · ベストアンサー

ご質問の趣旨とは違いますが、、、
精製度が悪くて制限酵素が効きにくいというのは、生き物（大腸菌とか組織）から取ったDNAの時には問題になりますが、PCR産物はきれいですからまず問題になりませんね。もとは生物から抽出したDNAにしても、ごく微量からPCRで増幅するのですから、PCR産物に対するコンタミは無視できます。
PCR産物をクローニングするときに問題になりそうなのは、
（１）プライマーに設計した制限酵素認識配列が、末端に近すぎて、制限酵素が効きにくい→制限酵素認識部位をプライマー末端から2塩基以上内側に設計する。
（２）プライマーダイマーがコンタミしていて、これが制限酵素で切断され、ベクターに高効率で組み込まれる→電気泳動ゲルから切り出しするとか、スピンカラムでプライマーダイマーを除去する。

また、
＞PCR産物が酵素で切断できていない可能性があり(電気泳動の時点では判断つかないので)
これは、制限酵素処理したPCR産物の一部をとって、それだけでLigation反応（室温5－10分で十分）して電気泳動すれば判断できます。制限酵素で消化されていれば、PCR産物が重合しているのが確認できるはずです（プライマー末端は通常リン酸化されていないので、Ligationしません）。

お礼

補足の訂正です。
失礼しました、(2)はプライマーのサイズが小さすぎて泳動で出るわけないですね。プライマーダイマーは考えていませんでした！コロニーが出ないので組み込まれているか分かりませんが。
いろいろな角度から見て行きたいと思います。ありがとうございました。

補足

丁寧な説明ありがとうございます。
(1)は10塩基くらい余計にプライマーの頭につけているので大丈夫です。
(2)PCR産物はすぐに定量のため少量電気泳動しているのですが、そのときはバンドはモノマー1本しかありませんでした。ちなみに定量後すぐ切断しています。
最後の文ですが、一部だけライゲーションはやってみるといいと思いました！ライゲーションそのものも成功してるのか分かりませんが…何か情報は得られそうです。
あまりに質問の幅が広くなるので今回質問を限定しましたが、切断、ライゲーション、トランスフォーメーションのうちのどこかなんですよね。先輩が実際に操作するとこを見てないので操作上の問題が心配です。

回答No.6

jellicle-cats

PCR産物を直接制限酵素処理→ライゲーションするのではなく、いったんTAクローニングした後に制限酵素で切り出して、目的のベクターにライゲーションする方法ではダメでしょうか？
二度手間かもしれませんが、この方法であれば、確実に制限酵素で切断できているのが確認できますし、これまでの方法でうまくいっていないのでしたら、この方法を試してみたらいかがでしょうか？

補足

アドバイスありがとうございます！TAクローニングはやったことはありませんが入りやすいと聞いています。どうしても入らない場合はそれも視野に入れてみようと思います。

回答No.5

TCA

最終的な結果として、トランスフォーメーション後にコロニーが生えてこないのでしょうか。それとも空のプラスミドばかりでPCR産物の入ったプラスミドを持った大腸菌が得られないのでしょうか。
後者の場合は、ライゲーション前にプラスミドの方をホスファターゼで脱リン酸化すると改善されることがあります。

補足

コロニーが生えないほうです。そちらで質問したほうが良かったのかもしれません。会社から購入したままのプラスミドは入ったのでトランスフォーメーションより前の段階が問題とは思うのですが。

回答No.4

sntk

私もプロトコル自体に問題はないと思います。
プロトコルではなく別の問題があるということは考えられませんか？
電気泳動で切断が判断できないということは、フラグメント末端を切っているのでしょうか？ＤＮＡ由来の制限酵素サイトを使っているのか、自分で付加した制限酵素サイトを使っているのかによっても違うかもしれませんが、メチル化の影響とかないでしょうか？確かに、ＤＮＡの精度が悪いと切れにくいと思いますが、私はＰＣＩ処理→エタ沈でうまくいきますよ。ＰＣＲ産物に問題がない限りは。精製が気になるなら、＃２の方が書かれたようにイソプロ沈してみてはどうでしょう？

補足

私もプロトコル以外の問題と思います。どこなのか分からないので本当に困っています。
PCRの際付加しているのでメチル化はしてないと思います。操作の仕方がまずいのか…

回答No.2

TCA

フェノール/クロロホルム抽出を習った時に言われたのは、古いフェノールは使わないことと、水層を回収する時にクロロホルムを混入させないことです。あとはフェノール廃液やフェノールの付着した廃棄物は人体に触れないように処理することです。

エタノール沈殿の際に溶液量が多くなってDNAの回収量が少なくなるようでしたら、イソプロパノール沈殿の方が良いかもしれません。

補足

う～ん混入は注意してるはずなのですが…有機溶媒はあまり扱ってないので参考になります。量的にはエタノールで大丈夫でした。

回答No.1

koganeton

プロトコルには、問題ないと思います。
経験からいうと、DNAの量と遠沈の
時間と回転数が問題になっていると
思います。
切断の有無は、コントロールにより
確認できると思うのですが？

補足

回答ありがとうございます。ng/μL単位で20分で遠心しています。。
コントロールといいますと？PCRの際両端に制限酵素サイトつけていますので…