制限酵素処理後のDNAの精製について

質問

マウスのゲノムDNAをMbo(1)やEcoR(1)で切断処理した後に、フェノ/クロ処理をしても全く精製されません。制限酵素処理を行なったマウスゲノムを使う時はProteinaseK処理も加えて行わなければならないのでしょうか？実験が全く進みません。経験のある方や、こうじゃないかと思われる方がおりましたら是非教えてください。お願いします。

回答No.2

noname#17364 · ベストアンサー

こんにちは。
なるほど、よくわかりました。
精製度を上げる方法として私が思いつくのは、
・2度、3度のフェノクロ→エタ沈
・DNA精製用のキット、あるいはカラム等を使用する
ということくらいです。
1.6というのは確かのちょっと汚い感じですね。一度、フェノクロ前の比とフェノクロ後の比で比べてみてはいかがでしょうか？つまり、本当にタンパクが除去されているのか、ということをチェックされてはいかがでしょうか。
　「その時点で変性云々」は、「精製されない」というのがもしかしたらDNAをロスしている、と言う意味の質問だったのかなと、最初思ったからです。失礼しました。
　あと、あえて気になったことがあるとすれば、抽出された時点でのDNAはきちんと精度が出ているのか、という点です。組織によっては夾雑物が取れにくいものもあるかと思うのですが、でもこれも普通は確認されてますよね？
　私が思いついたのはこのくらいです。お役に立ちますでしょうか？

お礼

詳しい説明ありがとうございました。
参考にして、早速検討してみたいと思います。
本当にありがとうございました。

回答No.1

noname#17364

こんにちは。
　「精製されません」の意味は、DNAが無くなってしまう、とうことですか？それとも、タンパクが除去されない、ということですか？
　制限酵素で切断する前には、当然DNAはある（存在する）わけですよね？DNAの抽出法は何を使っていますか？夾雑物によってその時点で変性していることはありませんか？

フェノクロのポイントは、
・フェノールがきちんとTEで平衡化されていること。古いものはpHがかわっている場合がありますので、1ヶ月以内くらいに作ったものがいいでしょう。
・フェノクロ液と、DNA溶液をきちんとエマルジョンになるまで混合すること。
くらいだと思います。そして、普通は吸光光度計で精製具合をチェックしますが、もしまだゴミが多いようならもう一度フェノクロをすることもあります。普通は制限酵素処理でしたら一回で十分でしょう。

補足を頂ければ、またアドバイスいたします。

補足

御回答、ありがとうございました。
補足させて頂きます。
「精製されない」と申しますのは、タンパクが除去されないという事です。
フェノクロ処理したDNAをエタチンし、TEに溶かしたものを一部希釈し吸光度を測定しております。
260/280での吸光度の比が1.6程度で、かなり精製されていないと考えています。
フェノール、クロロホルムは市販されているものでまだ新しい状態のものを使用しています。そしてnyanzowさんの回答にある「フェノクロのポイント」にある事はもちろん行った上で精製されないという事です。
フェノクロ処理している時のDNA濃度は100μg/ml程度になっていると思います。

「制限酵素で切断する前には、当然DNAはある（存在する）わけですよね？DNAの抽出法は何を使っていますか？夾雑物によってその時点で変性していることはありませんか？」
nyanzowさんが御回答なさいました上記の文ですが、「その時点で変性している」の箇所の解釈ができませんでした。申し訳ありませんがやさしく書いてもらえると有難い所存です。すみません。
DNAの抽出法ですが、Proteinase Kを用い、フェノクロ処理、次にRNase処理、フェノクロ処理を行ないました。

文才もなく、汚い文で申し訳ありません。
更なるアドバイスを頂けるとうれしく思います。